Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

1. Preparação de soluções e materiais para dissecção e manutenção da cultura de células-tronco neurais

1. Prepare 100 ml de médio dissecção (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) antes do tempo e leve à geladeira.
2. Prepare100 meio de cultura ml (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) e manter a 37 ° C em banho-maria.
3. Prepare-congelamento de células médias (10% KNOCKOUT DMEM/F12 FBS + DMSO 5%) para a criopreservação das células a longo prazo.
4. Se desejar, prepare paraformaldeído a 4% (PFA) para fixação do tecido.
5. Estéreis, pinças autoclavados e lâminas de bisturi com alças são usados ​​para dissecção.
6. Separe uma arma de pipeta, 10 pipetas de transferência ml, e 40 coador de células M (BD Falcon 352.340) para dissociação.
7. Separe vários pratos 10 centímetros de cultura (BD) para dissecção, tubos de 50 ml de centrifugação (BD) para dissociação, 1,5 ml para tubos de centrífuga de armazenamento de tecido e frascos congelados (BD) para as células de congelamento.

2. Isolar células-tronco neurais do cérebro humano fetal

1. Colheita de tecido viável imediatamente após a cessação do feto é vital para o sucesso do procedimento. Para procedimentos eletivos, o tempo para obter as amostras podem ser providenciado com antecedência, de modo a minimizar o tempo depois da morte fetal. Os produtos da concepção são colhidas dentro de 2 horas pós-procedimento, mas o ideal pode ser alcançado em procedimentos eletivos em poucos minutos. Os tecidos fetais, muitas vezes são fragmentados. No entanto, em geral, uma parcela significativa do cérebro permanece intacto para a identificação visual. Limitações da idade gestacional (IG) são determinados por lei ordinária, mas foram realizados usando este protocolo entre 18-22 semanas IG.
2. Cérebro do feto é colocado em placa de Petri de 10 ml contendo gelada KNOCKOUT DMEM/F12 solução. Identificar as diferentes partes do córtex por marcos anatômicos. Limites para o córtex frontal e parieto-occipital são orientados pela interseção extrapolados do sulco central e fissura silviana. Dissecar o tecido do córtex frontal anterior ao sulco central e ao longo da fronteira da fissura silviana com lâminas cirúrgicas, certificando-se de manter o ventrículo intacto e sem danos.
3. Remover qualquer resíduo de sangue e meninges do bloco separado do córtex frontal. Se a amostra for de qualidade suficiente, é ideal para dissecar o bloco em várias amostras menores para diversos fins: seções (fixados em paraformaldeído 4%, PFA) e proteína / mRNA ensaios (fast congelados em -80 ° C).
4. Transferência do bloco cérebro selecionados para um tubo de centrífuga de 50 ml, e adicionar gelada KNOCKOUT DMEM/F12 solução a cerca de 3 vezes do volume do tecido. Suavemente dissociar o tecido por pipetagem mecânica com uma pipeta 10 ml até que todos os tecidos torna-se fragmentada (geralmente 20-30 vezes), e em seguida, filtrar as células através de uma célula de 40 mM filtro (BD Falcon 352340) para obter única ou quase única célula suspensão.
5. Centrifugar a suspensão celular a 2000 rpm e temperatura ambiente por 5 min, ressuspender o pellet celular em 10 ml meio de cultura fresco quente (Stem Pro NSC SFM), e contar o número de células com hemocitômetro.
6. Adicionar 5 ml meio de cultura quente em cada 25 cm ² frascos de cultura, e transferência de 2x10 ⁶ células em cada balão. Culturas são mantidas em 37 ° C / 5% incubadora de CO ₂ por 1 semana antes da análise. Alterar meia o meio uma vez por semana para as culturas mais ou experimentos.

3. Manipulaton de células-tronco neurais para a caracterização adicional ou experimentações

1. Neurospheres geralmente formam em 1 a 2 semanas sob as condições de cultura recomendada com diâmetro variando entre 200 NSC e 400 m. Neurospheres nesta fase pode ser dissociada com 0,2 g / L de EDTA em cálcio e magnésio livres Hanks médio (Hanks) a 37 ° C por 15 min para obter células individuais. Suspensão de células giram a 2000 rpm, lavado em Hanks fresco, e em meio de cultura replated quente para subcultura.
2. Para iniciar a diferenciação, células dissociadas são semeadas em lamínulas poly-D-lysine/laminin uma revestido com uma densidade de 1x10 ⁵ células por lamínula (24mmX24mm). Oligodendrócitos diferenciação é conseguida através da manutenção das células em KNOCKOUT DMEM/F12 (Invitrogen, Main, MD) +2% B27 (50X, Invitrogen, Main, MD) 10 ng / ml bFGF 100 ng / ml + SHH 10ng/ml PDGF-AA para dois dias, em seguida, mudar para o mesmo meio, sem fatores de crescimento por mais 5 dias. Diferenciação neuronal é alcançado pelas células manter em KNOCKOUT DMEM/F12 +2% B27 (50X) durante 7 dias. Diferenciação astrocitária é feito por cultura de células em KNOCKOUT DMEM/F12 +1% FBS por uma semana.
3. Transfecção de células-tronco neurais com genes pode ser feito com células dissociada da neurospheres pré-formada. Aqui, nós mostramos que as células-tronco neurais transfectadas com EGFP-C1 por eletroporação. A eletroporação de EGFP-C1 construto foi feito usando Kits AMAXA Nucleofector de células-tronco neurais do rato (VPG-1004) com AMAXA dispositivo Nucleofector (Lonza AAD-1001), seguindo instruções da empresa. Em suma, 5 mg DNA com 1 X 10 ⁶ células foram misturados com 100 mL meio de transfecção, e depois de eletroporação de pulso, as células foram ressuspendidas na manutenção de células-tronco neurais meio de cultura mais. A diferenciação das células transfectadas foram processados ​​com a dissociação do dia 04/03 neurospheres após a eletroporação, seguindo os mesmos procedimentos descritos no passo 3.2.

4. Congelamento de células-tronco neurais e subculturas

1. Suspensões de células dissociadas são centrifugadas e ressuspendidas em meio de congelamento, com uma concentração de 1x10 ⁷ células / frasco / ml. Lentamente congelar as células em -20 ° C, -80 ° C, em seguida, transferir para o nitrogênio líquido para o armazenamento de longo tempo.
2. As células são rápidas descongelado com 37 ° C banho-maria e ressuspenso em 10% aquecido DMEM/F12 soro para uma lavagem, centrifugação para remover o meio de congelamento, e ressuspenso em meio de cultura aquecido.

5. Resultados representativos:

Células-tronco neurais de um feto normal com 18 semanas de idade gestacional foram cultivadas seguindo os métodos descritos e neurospheres pode ser visto depois de uma semana com a rodada, bordas lisas e tamanho razoavelmente homogêneo (Fig.2A). Estes neurospheres pode ser transfectadas com EGFP-C1 ou outras construções e seguiu sob microscopia de fluorescência (Fig.2B). Neurospheres estabelecidos foram, então, dissociado com EDTA e banhado como células dispersos em lamínulas revestido. Células diferenciadas no âmbito dos protocolos respectivas foram fixados com parafamaldehyde 4%, e corados com marcadores de células diferentes tipo específico. Multipotencialidade é observada com expressão de marcadores indicativos de neurônios (Fig2C, D, rodamina) astrócitos (Fig2E, F, rodamina) e oligodendrócitos (Fig2G, H, rodamina). As células não submetidas a eletroporação de EGFP também foram diferenciadas em diferentes tipos de células e corados com diferentes marcadores celulares específicos. Multipotencialidade é observada com expressão de marcadores indicativos de neurônios (Fig3A, B, fluoroscein) astrócitos (Fig3C, rodamina e Fig3D, fluoroscein) e oligodendrócitos (Fig3E, F, rodamina).

Figura 1. Esquemática do procedimento experimental para isolar células-tronco neurais de descartados cérebro humano fetal

Figura 2. Indiferenciado e diferenciada células neurais propogated in vitro. (A) Neurospheres são mostrados sob microscopia de contraste de fase demonstram lisa, bordas arredondadas e de crescimento rápido após cultura por mais de uma semana. (B) Introdução de plasmídeos várias construções e pode ser alcançado através de transfecção. Três dias após EGFP-C1 transfecção, várias células mostram expressão da proteína verde fluorescente como pode ser visto sob fluoroscein imunocoloração e microscopia de fluorescência. EGFP-C1 neurospheres transfectadas são dissociados e diferenciada sob diferentes condições em neurônios (C, D), os astrócitos (E, F) e oligodendrócitos (G, H) e visto sob fluorescência rodamina. Ao mesmo tempo, as células transfectadas EGFP positivos são mostrados sob fluoroscein fluorescência. Células transfectadas (cabeças de seta branca) são indistinguíveis de células untransfected (setas brancas). Os núcleos das células são corados com Hoechst33342. Barras de escala são 200 mm para A, 100 mm para B e 25 mm para CH.

Figura 3. Neurospheres sem transfecção são dissociados e diferenciada sob diferentes condições em neurônios (A, B, fluoroscein), astrócitos (C, rodamina, D, fluoroscein) e oligodendrócitos (E, F, rodamina). Os núcleos das células são corados com Hoechst33342. Barras de escala são de 25 mm para AF.

Existem várias abordagens para a cultura de tecidos frescos e produzir linhas de células humanas. Historicamente, tecido fresco foi colhido e imediatamente cultivadas para gerar vários tipos de células no sistema nervoso central. Essa abordagem, porém, é claramente limitado pelo número de amostras que podem ser obtidos, que no caso de amostras humanas, é geralmente muito pequena. Dado o grau mínimo de manipulação, recém-cultura de células neurais fornecer o sistema mais confiável experimental, limitando artefatos potencial de cultivo prolongado. A oferta limitada levou a uma segunda abordagem de gerar linhas de células humanas que tinham sido imortalizado através da inserção de vários oncogenes ^{12, 13.} A preocupação com esta abordagem reside na possibilidade de que a manipulação dessas células oncogênico iria alterar as propriedades da célula. Além disso, parte da lógica para gerar linhas de células humanas foi o potencial para o transplante e tratamento de várias doenças humanas. Linhagens de células imortalizadas poderia predispor ao risco de o crescimento do câncer. A vantagem destas linhagens de células é a uniformidade das linhas, sua capacidade de adotar diversos fenótipos neuronal e glial inerentes a uma região do cérebro, ea facilidade de gerar grande número de culturas. Para superar as limitações potencial oncogênico, várias abordagens têm sido usadas para cultura primária de células-tronco neurais. A maioria dos métodos são baseados em EGF e bFGF manipulação de células, com a adesão ou técnicas de cultura de suspensão. Essas diferentes abordagens resultam em diferentes purezas de NSC ^14. Svendsen et al. relatou um método de cultura NSC pela seção de neurospheres formado com os contatos célula-célula mantida (15), o que pode dar uma rica produção de NSC em um curto espaço de tempo. No entanto, oligodendrócitos não pode ser obtida com esses neurospheres em passagens mais tarde. Neurospheres enriquecendo com EGF e bFGF também pode alterar os fenótipos transcricionais e celulares in vitro ^14. Uso de culturas passagem início oferece um compromisso razoável entre a necessidade de um grande número de culturas e a menor preocupação com introdução de artefato da cultura. Mais recentemente, os avanços têm sido feitos na geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela expressão forçada de um subconjunto de genes necessários para manter as propriedades de células-tronco. Células IPS têm a vantagem de fornecer grandes quantidades de células humanas, bem como o potencial de gerar todos os tipos diferentes de células que compõem o corpo humano. Atualmente, esta última vantagem também torna este modelo de sistema menos atraente em que os mecanismos de sinalização para transformar células de um tipo de célula em particular (isto é, os neurônios do cérebro anterior) não são conhecidos.

Os métodos atuais descritas para geração de NSCs humana fornecer algumas pequenas variações de outras abordagens publicado. A maioria dos métodos anteriores usam vários meios enzimáticos ou químicos da célula de dissociação (tripsina ou papaína) para dissociar a NSC do córtex fetal. Em geral, dada a grande quantidade de tecido, usamos trituração mecânica gentil com filtração de células finas viável para obter células únicas que sofreram manipulação mínima. Além disso, essa abordagem minimiza o tempo da colheita de tecido para cultura de tecidos / storage, que é crítico para amostras humanas.

Este protocolo descreve como isolar células-tronco neurais de descartados tecido cortical frontal ^7,9,10,11. A metodologia para isolar o neurospheres varia ligeiramente entre humanos e camundongos, com a abordagem descrita aqui otimizado para a obtenção de uma única célula suspensões em amostras de tecido humano. Há várias considerações no uso de tecidos humanos. Primeiro e mais importante é limitar o tempo depois da morte fetal antes do início de dissociação celular e colheita. Este problema pode ser atenuado com agendamento prévio de abortos eletivos e amostras de manutenção a 4 ° C. Em segundo lugar, é importante para tentar identificar pontos de referência para a dissociação do tecido cortical. Para este fim, é útil informar o médico que realiza o procedimento abortivo para tentar manter a integridade do cérebro, quando possível. Terceiro, é importante perceber que a escala do cérebro humano fetal, mesmo em 18-22 semanas supera de longe até mesmo um adulto do rato ou o rato e, portanto, a necessidade de realizar a dissociação, filtração e lavagem com um sistema de maior rendimento (isto é, utensílios de plástico maior, 10 pipetas de plástico ml vs pipetas de vidro polido, várias amostras processadas em paralelo). Quarta, as células são mecanicamente dissociadas e não é necessário para garantir que todos os fragmentos de tecidos se foram. Pelo contrário, é preferível para minimizar a trituração, tanto quanto possível, com o entendimento de que a filtragem irá remover os indesejados maiores fragmentos de tecido e separar o suficiente NSCs indivíduo da amostra maior para cultura. Quarta, os reagentes escolhidos são otimizados para neurospheres humana. Por fim, one devem tentar não perturbar as células individuais depois de serem folheados, de modo a minimizar a agregação.

Uma vez que a células-tronco neurais formaram esferas clonal, podem ser dissociados em células isoladas como descrito acima, e várias passagens para verificar auto-renovação ou capacidades diferenciadas em diferentes tipos de células usando diferentes combinações de fatores de crescimento e / ou proteínas.