Зрительный нерв размозжение мышиной моделью для изучения сетчатки выживания клеток ганглия

Все оборудование и реагенты, используемые стерильны. Все эксперименты на животных, были утверждены уходу за животными и использование комитета (ACUC) на NEI / NIH (исследования на животных, протокол НОУ-570), а также были проведены в соответствии с НИЗ руководящие принципы и правила.

1. Базовый Ретроградная Маркировка ганглиозных клеток сетчатки (РГК) В день 1

Целью этой процедуры является этикетка ганглиозных клеток сетчатки ретроградно путем введения красителя нейронных трассирующими в верхний бугорок мышей за три дня до оптических травмы раздавить нерва. Краситель будет ретроградно рассмотрен ганглиозных клеток сетчатки и обеспечивает маркером жизни РГК (рис. 1). Такой подход позволяет получить воспроизводимые маркировки жизнеспособных РГК с небольшим изменением ^1-5.

1. Глубоко анестезию мыши. Чистая волос на верхней части головы. Наведите в небольшом стереотаксического аппарата. Защитные oinment применяется для обоих глаз. Лечить коже головы три раза в использовании йодофора и 70% спирта скраба.
2. Сделайте надрез в коже, чтобы подвергать черепа, и держать его сухим и чистым, используя 3% перекиси водорода.
3. Определите и отметьте брегмы. Просверлите отверстие выше верхний бугорок на 2,9 мм за темя и 0,5 мм сбоку от средней линии каждого полушария ^7. При бурении применяют солевой на сайт, где бурится отверстие для предотвращения вторичного повреждения тепла.
4. Использование стереотаксического устройства измерения и шприц Гамильтон, вводят FluoroGold нейронных трассирующими красителя (1 мкл 3% флуорохромами в физиологическом растворе) очень медленно в верхний бугорок каждого полушария на глубине 1,6 мм от костлявой поверхности мозга.
5. Шовный разреза. Дайте подкожного введения бупренорфина для обезболивания.
6. Подведите указатель мыши к теплой и сухой области и следить за ним, пока он не в состоянии поддерживать вертикальное положение, и вернуть его в исходное клетке. В течение первых трех дней после процедуры маркировки, системные анальгетики (например, бупренорфин) и актуальные мазь с антибиотиком даны два раза в день и мышь находится под пристальным контролем.

2. Оптические Травма Давка нерва на 4-й день

В этой процедуре, мы будем применять раздавить повреждения зрительного нерва вызывает первичного повреждения аксонов (рис. 2), что приведет к постепенной гибели ганглиозных клеток сетчатки.

1. Через три дня после нанесения красителя трассирующими, мыши глубоко под наркозом. Использование рассекает микроскоп, конъюнктивы глаз вырезается примерно в 4:00 позицию, используя пару весной ножницами.
2. Аккуратно отвлечь орбитальных мышц и положить их в сторону. Expose белый зрительный нерв при выходе ее из глаз земного шара. Будьте особенно внимательны, чтобы не повредить кровеносные сосуды.
3. С помощью пары встречный иск щипцами, нанесите раздавить повреждение зрительного нерва примерно в 2 мм от глазного яблока в течение примерно 3 секунд. Будьте особенно внимательны, чтобы не повредить глазной артерии, чтобы вызвать кровотечение.
4. После завершения размозжение, разрез зашивается.
5. Перед мыши оправится от анестезии, дают подкожного введения бупренорфина для обезболивания.
6. Подведите указатель мыши к теплой и сухой области и следить за ним, пока он не в состоянии поддерживать вертикальное положение и вернуть его в исходное клетке. В течение первых трех дней после процедуры травмы раздавить, системные анальгетики (например, бупренорфин) и актуальные мазь с антибиотиком даны два раза в день и мышь находится под пристальным контролем.

3. Урожай сетчатки и анализ РГК Выживание На 11 день

Целью этой процедуры является урожая retinaeto анализ сетчатки выживания клеток ганглия.

1. В день 11 (7-й день после ONC), мышь эвтаназии СО ₂ инфузии и шейки дислокации.
2. Глаза извлекли ядра с помощью пара щипцов, применяя давление на орбиту.
3. Глаза фиксировали в 4% параформальдегида решение в течение двух часов и промывали в PBS в три раза. Рассеките сетчатки. Процедура вскрытия сетчатки уже был опубликован ранее Юпитеру в 2010 году Gustmann, С. и соавт. ^6, а, следовательно, не будут описаны здесь.
4. Изображения выживших ганглиозных клеток сетчатки взяты использованием флуоресцентного микроскопа в определенных регионах сетчатки, и плотность клеток сетчатки ганглия могут быть подсчитаны. Представитель результате флуоресценции меченых ганглиозных клеток сетчатки с или без оптического травмы раздавить нерва показано на рисунке 3.

4. Представитель Результаты:

Для анализа выживания клеток сетчатки ганглия, через семь дней после травмы раздавить оптических нервов, сетчатки были собраны, фиксированные, сплющенные и смонтированы. Сетчатки изображения выполнены при помощи флуоресцентного микроскопа. По сравнению с неповрежденной нормальной тetina (слева, Normal), количество жизнеспособных РГК (зеленый, ретроградно помечены FluoroGold нейронных трассирующими краситель вводится в верхний бугорок) значительно ниже, сетчатки с оптической травмы раздавить нерва (справа, ОНК) (рис. 3) .

Рисунок 1. Базовый ретроградной маркировки ганглиозных клеток сетчатки
Для того, чтобы считать жизнеспособными ганглиозных клеток сетчатки в различные моменты времени после травмы раздавить оптических нервов, ганглиозных клеток сетчатки помечены ретроградно, вводя нейронных трассирующими красителя (зеленый цвет) в верхний бугорок в головном мозге за три дня до зрительного нерва ( красный) раздавить травм. С аксонов ганглиозных клеток сетчатки проживают в верхний бугорок, краситель трассирующими будет рассмотрен РГК ретроградно и обеспечивает маркером жизни РГК.

Рисунок 2. Оптические травмы раздавить нерва
В целях анализа состояния сетчатки выживания клеток ганглия, размозжение применяется к зрительному нерву (красный), чтобы заставить первичные повреждения аксонов. Это приведет к постепенной гибели ганглиозных клеток сетчатки. Через три дня после трассирующими красителя (зеленый) инъекции, мышь под наркозом. Конъюнктивы один глаз надрезанные. Deflect орбитальных мышц и положить их в сторону. Expose зрительного нерва при выходе ее из глаз земного шара. Применить раздавить повреждение зрительного нерва примерно в 2 мм от глазного яблока в течение 3 секунд с помощью пары встречный иск щипцами.

Рисунок 3. Флуоресценции меченых ганглиозных клеток сетчатки с или без оптического нерва травмы сокрушить
Для анализа выживания клеток сетчатки ганглия, через семь дней после травмы раздавить оптических нервов, сетчатки были собраны, фиксированные, сплющенные и смонтированы. Сетчатки изображения выполнены при помощи флуоресцентного микроскопа. По сравнению с неповрежденной нормальной сетчатки (слева, Normal), количество жизнеспособных РГК (зеленый, ретроградно помечены FluoroGold нейронных трассирующими краситель вводится в верхний бугорок) была значительно ниже в сетчатки с оптической травмы раздавить нерва (справа, ONC ) (рис. 3). Шкала бар: 50 мкм

Зрительный нерв размозжение мышиной модели полезно изучить процесс РГК смертью и выживанием. Эта модель также часто используется для исследования влияния различных реагентов и генов апоптоза РГК и выживания. Одно из преимуществ этой модели является то, что он имеет высокую степень воспроизводимости с минимальными вариациями.

Тем не менее, то требуется особая осторожность в несколько этапов в этой модели. Во-первых, при создании оптических травмы раздавить нерва, важно не использовать слишком много сил и, чтобы не раздавить слишком долго, потому что они могут привести к повреждению артерий офтальмологические и поэтому последующие сетчатки ишемии. Кроме того, при попытке выставить зрительного нерва, следует проявлять большую осторожность, чтобы не повредить другие окружающие кровеносные сосуды мышей глаз.