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 JoVE Immunology and Infection

의 검출을위한 형광 단백질 화학의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기에 ( I. punctatus) 샘플

,

Department of Basic Sciences, Mississippi State University

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Cite this Article: 의 검출을위한 형광 단백질 화학의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기에 ( I. punctatus) 샘플

Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples. J. Vis. Exp. (51), e2687, doi:10.3791/2687 (2011).

Abstract: 의 검출을위한 형광 단백질 화학의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기에 ( I. punctatus) 샘플

Edwardsiella ictaluri 채널 메기 Ictalurus punctatus의 주요 병원체이며 1,2 전 약 30 년간을 발견하고있는 동안, 지금까지,이 작가 '지식의 최고에, 어떤 방법의 현장 시각화에 수 있도록 개발되지 않았습니다 histological 섹션에 박테리아.

세균성 지방화는 플레이트 카운트 3, radiometric 표시된 4, 또는 발광 생물 세균 5를 사용하고 이전의 연구에서 생체내 결정하고있는 동안, 이러한 연구의 대부분은 한 가지 예외를 제외하고 6, 총 장기 수준에서 수행되었습니다. 이 제한은 특히 우려 때문에 E. ictaluri는 복잡한 감염 사이클 1,7을 가지고 있으며, 그것은 독성 요인 8,9 다양한 있습니다. E.의 복잡한 상호 작용 그 호스트 ictaluri 같은 taxonomic 가족에 살모넬라 균 10, 많은 측면에서 비슷합니다.

여기 에인 즈 워스 외 의해 설명되어있는 단클론 항체를 사용하여 Ed9 간접 단백질 histochemistry. 11을 사용하여 박테리아의 탐지를 위해 허용하는 방법을 설명합니다.

간단히 차단 혈청가 아닌 특정 기다리는을 방지하기 위해 파라핀 임베디드 histological 섹션에 적용됩니다. E. 그런 다음 섹션은 기본 항체와 incubated 아르 ictaluri 특정 단클론 항체 Ed9. 초과 항체가 떨어져 씻어서되고 FitC 라벨 이차 항체가 추가됩니다. rinsing 후, 섹션은 형광등 특정 설치 매체로 탑재하고 있습니다.

이것은 E.의 검색 허용 채널 메기 조직의 histological 섹션에 현장에 ictaluri.

Protocol: 의 검출을위한 형광 단백질 화학의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기에 ( I. punctatus) 샘플

1. 세균 도전

  1. 30 박테리아가 하룻밤 사이에 성장 ° 뇌 심장 주입 용기를 흔들어에서 C.
  2. 물고기 탱크의 물 순환을 중지하고 100 1 농도 (리터 당 10 ML, 예를 들어)에 국물을 추가합니다.
  3. 한 시간 부화 후, 남아있는 세균을 제거하기 위해 탱크에 물을 순환을 다시 시작합니다.

2. 샘플링

  1. 샘플링 시간과 기관은 연구의 목적 의존하지만 우리 연구에서, 우리는 다음과 같은 샘플링 포인트 사용 : 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 1​​10, 125 및 175시간 후 감염 .
  2. 아가미, 측면 라인, 소장, 비장 따라 사후 근육, 각 시간 점에서 MS222과 샘플 다음과 같은 장기 (샘플 기관의 선택은 감염 과정의 알려진 내용에 기초)가 포함된 물에 침수에 의해 여섯 물고기를 안락사 간, 위, 심장, 머리를 신장하고, 트렁크 신장.
  3. 샘플링시 즉시 histological 카세트에서 장기 하중, 1 % 포르말린에 두 시간 동안 그들을 담가.
  4. 그들은 삽입 때까지 남아 두명의 시간 고정 후, 포르말린에서 50 % 에탄올로 카세트를 전송합니다.
  5. 파라핀은 하룻밤 조직 테크 VIP 3000 조직 프로세서 (사쿠라 테크, 토랜스, 캘리 포니 아주)와 Leica RM2255 microtone을 (Leica 이크로 시스템즈, 배녹번, 일리노 이주)를 사용하여 5μm에서 섹션을 사용하여 장기 포함.

3. Dewaxing 섹션

  1. 디졸브 모든 왁스 수 있도록 약 5 분 맑은 의식으로 가득 얼룩 여물 섹션 젖어. 랙을 들어 여분의 왁스는 용매에서 배수.
  2. 5 분 분명 라이트의 두 번째 용기에 섹션 젖어. 몇 가지 사용 후, 첫 번째와 두 번째 컨테이너 사이의 첫 번째 컨테이너와 대체의 용매를 교체하십시오.
  3. 왁스는 용매 제거 100 % 알콜에있는 섹션을 잠그다.
  4. 100 % 알코올의 두 번째 여물 섹션 젖어.
  5. 70 % 알콜의 여물 섹션 젖어.
  6. 알코올의 모든 흔적을 제거하는 수돗물을 실행에있는 섹션을 잠그다.

4. 버퍼 준비

  1. 칼륨은 7.4에 증류수와 산도의 1리터에 8.0 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.15 g 나 2 HPO 4 0.2 g KH 2 PO 4 용해하여 생리 버퍼 준비합니다.
  2. 증류수 100 ML에 PBS 900 ML 추가하여 0.9X에 PBS를 희석.
  3. 2 ML 마우스 혈청을 추가하여 혈청 차단 준비 200 μl 트리톤 - X 100, 500 μl PBS BSA 0.9X 50 ML에 있습니다.
  4. 50 MM의 비카보네이트 버퍼 살린 500 ML 증류수 H 2 O에서 2.1 g NaHCO 3 4g NaCl을 해소하고 산도 8.2 titrated에 의해 준비가되어 준비합니다.

5. Immunhistochemistry

  1. 0.9X PBS에서 침수로 섹션을 Rehydrate.
  2. 혈청을 차단 30 분 동안 슬라이드를 품어.
  3. 상온에서 불투명 습한 챔버에 두 시간 동안 Ed9 (차단 혈청에서 100에 1을 희석)에 섹션을 품어.
  4. 십분 각 섹션에게 PBS로 4 번 린스.
  5. 상온에서 불투명 습한 챔버에서, 보조 항체의 50 μl (혈청 차단 500 번 희석 염소 방지 마우스 FitC 표시 항체)에 두 시간 섹션을 품어.
  6. 비카보네이트 3 시간이 호수 버퍼 섹션 린스.
  7. 탈이온수에서 잠시 섹션 린스.

6. 설치

  1. 몇 분 동안 어둠 속에서 건조하는 슬라이드를 둡니다.
  2. 장착은 permafluor를 사용하여 수행됩니다.
  3. 장착 매체 어두운 시원한 환경에서, 우선적으로 야간, 건조에 둡니다.

7. 현미경

  1. Histological 섹션 형광 현미경으로 관찰하기 위해 준비가되어 있습니다. 필터, 우리의 실험에서, 우리는 트리플 (MCA 텍사스 - 레드 FitC)을 갖춘 올림푸스 BX51 현미경을 사용. 액자 소프트웨어 (MicroFire, 골레타, 캘리포니아)이 사용되었다.

8. 대표 결과 :

물고기 조직의 자동 형광 그렇게 높이 때문에,이 조직은 편리 박테리아에 대한 배경을 제공 트라이 필터 아래에 오렌지가 나타납니다.

이 배경, 개별 FitC 묻은​​ 박테리아는 밝은 녹색 점들로 표시되며, 200X에서 자신의 막대 모양은 (그림 1) 인식할 것입니다.

잘못된 부분은 박테리아의 큰 숫자가 균일하게 슬라이드에있는 것으로 표시되는 경우 (rinsing 단계에서이 문제로 인해) 잘못된 긍정을 구성하실 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 2 E. 보여주는 근육 섹션 현미경 ictaluri (화살표 A와 B) (200x).

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그림 2. 실험의 전체 구조

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Discussion: 의 검출을위한 형광 단백질 화학의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기에 ( I. punctatus) 샘플

이 프로토콜 세부 histological 섹션에서 메기 병원체 Edwardsiella ictaluri의 현장 시각화에 대한 기술. 우리의 지식의 최고하려면,이 설명 첫 번째와 같은 프로토콜입니다.

가장 중요한 단계는, 우리의 경험, 잘못된 긍정을 초래할 수로 불충 분한 세척으로 현재 프로토콜의 단계 4.4에서 설명하는 항체의 rinsing입니다.

이 기법의 결과를 해석과 함께 가장 큰 문제는 조직의 자동 형광이다. 그러나, 그것은 아닌 특정 형광의 대다수로 트라이 필터 대부분 해결되는 문제를 사용하면 녹색 형광 스펙트럼의 밖에서 발생하는 것으로 나타났다. 또한,이 기법은 매우 민감한 반면, 그것은 낮은 박테리아 하중을 감지하지 못할 수 있습니다.

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Disclosures: 의 검출을위한 형광 단백질 화학의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기에 ( I. punctatus) 샘플

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements: 의 검출을위한 형광 단백질 화학의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기에 ( I. punctatus) 샘플

저자는 그들의 지원은 개발과 immunohistochemistry를 수행하는 기술 미쉘 베인스의 지원뿐만 아니라 박사 페트리 - 핸슨 박사와 티모시 브라운 에얼스를 인식하고 싶습니다. 이 프로젝트는 USDA 크리스 프로젝트 # MISV - 0801310로 및 동물용 의약품의 미시시피 주립 대학에 의해 투자되었다.

Materials: 의 검출을위한 형광 단백질 화학의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기에 ( I. punctatus) 샘플

Name Company Catalog Number Comments
Brain Infusion broth BD Biosciences 237200
MS222 Argent Labs
Whole mouse Serum Cappel 55989
Goat anti-mouse FitC SouthernBiotech 1010-04
Permafluor Lab Vision Ta-030-FM
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P-4504
Triton-X Sigma-Aldrich X100-6X500ML
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich 85040C
Potassium phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P-5379
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S-5761
Sodium chloride (NaCal) Sigma-Aldrich S-9625
Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) Sigma-Aldrich S-9390

References: 의 검출을위한 형광 단백질 화학의 이용 Edwardsiella ictaluri 채널 메기에 ( I. punctatus) 샘플

  1. Plumb, J.A. in Fish Diseases and Disorders, edited by P. T. K. Woo and D. W. Bruno (CABI Publishing, New York, 1998), Vol. 3, pp. 479.
  2. Roberts, R.J. Fish Pathology, third ed. (WB Saunders, 2001).
  3. Lawrence, M.L. Louisiana State University, 1997.
  4. Nusbaum, K.E. and Morrisson, E.E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health 8, 146 (1996).
  5. Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S. and Lawrence, M.L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters 260 (2), 216 (2006); Karsi, Attila and Lawrence, Mark L., Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid 57 (3), 286 (2007).
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  7. Areechon, N. and Plumb, J.A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society 14, 249 (1983).
  8. Dumpala, P.R., Lawrence, M.L. and Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics 9 (5), 1353 (2009).
  9. Thune, R.L., et al. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology 73 (24), 7934 (2007); Karsi, Attila et al., High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology 75 (7), 2166 (2009).
  10. Hook, E.W. in Principles and Practices of Infectious Diseases.. edited by Gerald L. Mandell, R. Gordon Jr. Douglas, and John E. Bennett (Churchill Linvingstone, New-York, 1990), Vol. 1, pp. 1700.
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