उच्च संकल्प 3 डी इमेजिंग के पूर्व - Vivo जैविक नमूने माइक्रो सीटी

Sharir, A., Ramniceanu, G., Brumfeld, V. High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT. J. Vis. Exp. (52), e2688, doi:10.3791/2688 (2011).

गैर विनाशकारी मात्रा दृश्य tomographic तकनीक, जिनमें से सबसे कुशल एक्स - रे सूक्ष्म कंप्यूटरीकृत टोमोग्राफी (μCT) द्वारा ही प्राप्त किया जा सकता है.

उच्च संकल्प μCT पूर्व vivo जैविक नमूने ^{1, 2} 3 डी परीक्षा के लिए एक बहुत बहुमुखी अभी तक सटीक तकनीक (संकल्प के 1-2 microns) है. के रूप में इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी करने का विरोध किया, μCT 4 सेमी मोटी नमूने के की परीक्षा की अनुमति देता है. इस तकनीक माप की केवल कुछ घंटे की आवश्यकता है ऊतक विज्ञान में सप्ताह के रूप में की तुलना में. इसके अलावा, μCT 2D stereologic मॉडल पर भरोसा नहीं करता, इस प्रकार यह पूरक हो सकता है और कुछ मामलों में भी histological ^{तीन तरीकों, 4,} जो दोनों समय लेने और विनाशकारी हैं जगह ले सकता है. नमूना और μCT में कंडीशनिंग स्थिति स्पष्ट है और उच्च वैक्यूम या कम तापमान, जो प्रतिकूल संरचना को प्रभावित कर सकता है की आवश्यकता नहीं है. नमूना तैनात है और 180 ° या 360 ° microfocused स्रोत एक्स - रे और एक डिटेक्टर, जो एक scintillator और प्रत्येक कोण एक 2d छवि को ले लिया है के लिए एक सटीक सीसीडी कैमरा, शामिल हैं के बीच घुमाया, और फिर पूरी मात्रा एक का उपयोग खंगाला है विभिन्न उपलब्ध एल्गोरिदम के ^5-7. 3D संकल्प रोटेशन कदम की कमी के साथ बढ़ जाती है. वर्तमान वीडियो प्रोटोकॉल तैयारी स्थिरीकरण, और उच्च संकल्प इमेजिंग द्वारा पीछा नमूना की स्थिति में मुख्य कदम से पता चलता है.

1. नमूना तैयार

1. ऊतक है जो जांच की जा है निकालने के बाद, mineralized ऊतकों साधन में तैनात किया जा सकता है है और imaged. छवि के लिए माउस फीमर एक निम्न चरणों का पालन करें:
   1. C57/Bl6 भ्रूण 18.5 दिनों postceutus (E18.5) से पोस्टमार्टम पैर पोस्ट निकालें.
   2. एक polystyrene विंदुक टिप epoxy राल या एक और गोंद का उपयोग कर (2-20 μl) की संकीर्ण अंत सील, और काम कर बफर (पीबीएस या अन्य) के साथ टिप भरें.
   3. कसकर टिप में पैर फ़िट और parafilm पत्र के साथ दूसरे छोर सील.
   4. एक उपयुक्त धारक में पिपेट टिप प्लेस और अध्याय 3 से प्रोटोकॉल का पालन करें. माउस पैर भ्रूण से फीमर visualizing के लिए, उपकरण 40 केवी और 200 μA के सेट कर दिया जाता है. 8μ संकल्प के लिए 1000 4x बढ़ाई साथ प्रक्षेपण छवियों को प्राप्त किया जाता है.
2. गैर-mineralized ऊतकों करने के लिए शुरू और तय किया जा दाग क्रम में कई उपलब्ध ^8,9 प्रोटोकॉल का उपयोग करके हित के ऊतक के एक्स - रे क्षीणन में वृद्धि है . चूहे फेफड़ों और इसी तरह के नमूने के लिए, तैयारी प्रोटोकॉल है:
   1. नग्न चूहे फेफड़ों पर गैर छोटे सेल फेफड़ों (NSCLC) NCI-H460 कार्सिनोमा के Orthotopical आरोपण
   2. फेफड़ों के कैंसर पिंड detectable जा रहा है आरोपण से 4 सप्ताह के शुरू
   3. चूहे बलिदान और तुरंत यह खारा हेपरिन के साथ मिश्रित समाधान के साथ पानी में डालना
   4. यह Microfil (Flowtech) के एक पतला समाधान (यौगिक समाधान, मंदक के 3 मिलीग्राम और इलाज एजेंट के 0.3 मिलीलीटर 2 मिलीलीटर) के साथ बाएं वेंट्रिकल में ब्रोन्कियल परिसंचरण दाग इंजेक्षन
   5. चूहे के फेफड़े और दिल निकालें
   6. यह एक 50 मिलीलीटर प्लास्टिक टेस्ट ट्यूब में कसकर ढाले नमूना स्थिर (अध्याय 2 प्रोटोकॉल देखें)
   7. ट्यूब के नीचे एक कपड़े इथेनॉल में damped पर रखकर एक संतृप्त इथेनॉल माहौल बनाएँ
   8. गोंद या पेंच साधन के एक धारक में ट्यूब
   9. इमेजिंग पैरामीटर (3 अध्याय) की स्थापना के साथ आगे बढ़ें. चूहे फेफड़ों की पूरी इमेजिंग के लिए स्रोत 40KV और 100 μA पर सेट कर दिया जाता है. आदेश में 16μ संकल्प तक पहुँचने के लिए एक 0.5x एक magnification पर 2500 प्रक्षेपण छवियों अधिग्रहण किया है.

2. नमूना स्थिरीकरण

उच्च संकल्प, यह महत्वपूर्ण है के लिए माप के दौरान नमूना स्थिति में किसी भी परिवर्तन से बचने के. इस के लिए, नमूना कसकर एक प्लास्टिक प्राप्तकर्ता है कि इसके आकार फिट बैठता है में तय हो गई है. Polystyrene विंदुक युक्तियाँ, प्लास्टिक पाश्चर pipettes या विशेष रूप से निर्मित प्लास्टिक धारकों को इस संबंध में उपयोग किया जाता है. प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार, नमूना हवा में जांच किया जा सकता है या इथेनॉल या बफर समाधान में डूब. ठेठ स्थिरीकरण और साधन में माउस भ्रूण के पैर के अंतिम स्थिति 1 अंजीर में दिखाया गया है.

चित्रा 1. सूक्ष्म सीटी साधन में भ्रूण माउस पैर की अंतिम स्थिति.

3. अधिग्रहण पैरामीटर सेट: एक्स - रे वोल्टेज और मौजूदा, सीसीडी जोखिम समय

1. एक धारक में रखा, नमूना साधन के रोटेशन चरण में डाल दिया है
2. वोल्टेज और मौजूदा मनमाने ढंग से सेट के साथ एक पहली छवि एक्सरे लिया जाता है.
3. यदि छवि भी अंधेरा है, एक photons की संख्या में वृद्धि करनी चाहिए पहले, तो एक छोटा सा वर्तमान में वृद्धि. यदि यह पर्याप्त नहीं है, एक थोड़ा एक्स - रे फोटॉनों की ऊर्जा में वृद्धि करनी चाहिए, यानी एक्स - रे ट्यूब पर वोल्टेज.
4. यदि छवि बहुत उज्ज्वल है, एक पहले वोल्टेज में कमी करना चाहिए, तो वर्तमान.
5. छवि की चमक binning की वृद्धि हुई किया जा सकता है है. 1 के Binning खाते में छवि में प्रत्येक पिक्सेल की तीव्रता लेता है, जबकि 2 की binning 2x2 पिक्सल के प्रत्येक मैट्रिक्स की राशि लेता है. छवि के बारे में 4 बार एक binning के मामले में की तुलना में उज्जवल हो जाएगा, लेकिन आधा संकल्प होगा.
6. इष्टतम चमक स्थापित करने के बाद, एक करने के लिए कैमरे के एक तरफ और दूसरे पक्ष पर प्रयोग का एक उचित अवधि पर सबसे अच्छा इसके विपरीत के बीच समझौता जोखिम समय का अनुकूलन है.
7. विशेष रूप से कम अवशोषित नमूनों की छवियाँ, के विपरीत, फिल्टर, जो कि मुख्य रूप से कम ऊर्जा photons के फोटॉन प्रवाह, कम का उपयोग करके सुधार किया जा सकता है.

4. नमूना स्थिति

1. काम कर बढ़ाई चुनें. संभव विकल्प 0.5x, 4x, 10x, 20x और 40x हैं. देखने के क्षेत्र में बढ़ती बढ़ाई साथ घट जाती है.
2. स्रोत एक्स - रे और नमूना के बीच और नमूना और डिटेक्तार के बीच दूरी की स्थापना द्वारा इष्टतम संकल्प और देखने के क्षेत्र जाओ. नमूना दूरी के स्रोत बढ़ाने देखने के क्षेत्र घट जाती है और संकल्प बढ़ जाती है. डिटेक्टर दूरी के लिए नमूना विपरीत प्रभाव पड़ता है है.

पूरे क्षेत्र के लिए 3 डी में देखा जा में मौजूद होना चाहिएप्रक्षेपण छवि सभी कोणों पर. एक नमूना घूर्णन द्वारा विभिन्न कोणों पर और नमूना लाने के रूप में के रूप में बंद के घूर्णन अक्ष के लिए संभव द्वारा इस की जाँच करनी चाहिए. इस के लिए, एक निम्न चरणों का पालन करना चाहिए:

3. 0 डिग्री में एक छवि ले लो, और फिर -20 डिग्री पर नमूना बारी बारी से. यदि वांछित मात्रा पार्श्व स्थानांतरित कर दिया गया है, एक घूर्णन अक्ष repositioning के द्वारा अपनी स्थिति को सही चाहिए.
4. सुधार के बाद, नमूना के लिए एक अन्य कोण पर घुमाया जा रहा है और स्थिति फिर से सही है, जब तक ब्याज के क्षेत्र सभी -90 से 90 डिग्री के कोण पर छवि के अंदर है.

5. उच्च संकल्प tomogram

1. माप के दौरान, नमूना एक समय में एक छोटा सा कोण और प्रत्येक कोण एक प्रक्षेपण छवि पर घुमाया गया है ले लिया है. छवियों की कुल संख्या हमेशा एक तरफ वांछित संकल्प और माप और दूसरे पक्ष पर फ़ाइल आकार के समय के बीच एक समझौता है. Fig.2 में दिखाया गया है, हर एक प्रक्षेपण शामिल नमूना में सभी स्लाइस एक दूसरे पर superposed, और इसलिए नमूना के 3D संरचना नहीं प्रकट कर सकते हैं.

चित्रा 2. 0 ° (ए), 45 ° (बी) और 90 ° रोटेशन कोण (सी) में चूहे के फेफड़ों के प्रोजेक्शन छवियाँ.

2. -90 और 90 डिग्री के बीच कम से कम प्रक्षेपण चित्र लेने के बाद ही, एक नमूना मात्रा के पुनर्निर्माण के लिए आगे बढ़ सकते हैं. पुनर्निर्माण 10 मिनट और 2 घंटे के बीच लेता है, इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के अनुमानों की संख्या के निर्भर करता है. फिर से, 3 डी छवि के अंतिम गुणवत्ता वांछित संकल्प और समय बिताना चाहता है और परिणामी फ़ाइल के आकार के बीच एक समझौता है.

6. छवि पैमाने अंशांकन

एक खंगाला छवि में पिक्सेल स्तर (मान) है कि छवि के लिए अद्वितीय है. क्रम में दो अलग छवियों की तुलना करने के लिए, एक अद्वितीय तीव्रता पैमाने पर करने के लिए प्रत्येक छवि पर लगाया जा है. इस के लिए

1. एक मानक प्रेत के साथ एक नमूना के लिए के रूप में एक ही प्रयोगात्मक शर्तों का उपयोग टोमोग्राफी भागो
2. नमूना प्रेत के लिए प्राप्त मानों का उपयोग कर छवि recalibrate. सबसे आम पैमाने Hounsfield पैमाने (या सीटी) है. 4x बढ़ाई के लिए 15,000 पृष्ठभूमि मूल्य (पानी या पीबीएस के लिए) 0 के साथ बदल दिया गया था और हड्डी के लिए 35,000 के अधिकतम मूल्य 3000 के मानक Hounsfield मूल्य के साथ प्रतिस्थापित किया गया था. अन्य पिक्सेल मूल्यों के रैखिक प्रक्षेप या उन सीमाओं के आधार पर एक्सट्रपलेशन से हुई.

7. इमेज प्रोसेसिंग और विश्लेषण

उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के बाद, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रासंगिक जानकारी निकालने के लिए है. सॉफ्टवेयर पैकेज के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए बहुत बड़ी फ़ाइलों (20GB करने के लिए) के साथ कार्य करने के लिए डिज़ाइन किया गया है.

8. प्रतिनिधि परिणाम

एक C57/Bl6 माउस से एक फीमर के एक भ्रूण 18.5 दिन (E18.5) में प्रतिनिधित्व - खनिज प्रक्रिया के दीक्षा के बाद चार दिन 3 चित्र में दिखाया गया है. खनिज परतों स्पष्ट रूप से दिखाई (सफेद) कर रहे हैं, जबकि मुलायम ऊतकों इस तैयारी में दिख नहीं रहे हैं. हम 4x के एक रेखीय आवर्धन के साथ 1000 प्रक्षेपण छवियों लिया. अंतिम संकल्प 8 microns है. मात्रा Fig.1 में दिखाया प्रतिपादन का एक सावधान विश्लेषण से पता चलता है, कि हड्डी की मात्रा अंश (हड्डी की मात्रा है कि mineralized ऊतक द्वारा कब्जा है के अंश) 0.18 है, और अस्थि खनिज ^{घनत्व} 723 मिलीग्राम / 3 सेमी है. उन मूल्यों हमें विकास के अन्य चरणों में हड्डियों के साथ इस संरचना की तुलना करने के लिए अनुमति देते हैं.

चित्रा 3 एक माउस फीमर भ्रूण के एक 3D छवि के विभिन्न अभ्यावेदन. आड़ा (अनुभाग पार) (ए), sagital (medio पार्श्व) खंड (बी) और मात्रा प्रतिपादन (सी) का एक स्नैपशॉट दिखाए जाते हैं.

चित्रा 4 में एक महिला नग्न चूहा (RNU), 12 सप्ताह पुरानी है, गैर छोटे सेल फेफड़ों (NSCLC) NCI-H460 कार्सिनोमा के साथ प्रत्यारोपित orthotopically के फेफड़ों के एक 3D छवि दिखाता है. 2500 प्रक्षेपण छवियों 0.5x के एक रेखीय बढ़ाई साथ ले जाया गया, 16 microns के एक अंतिम समाधान सुनिश्चित करने. छवि Microfil सना हुआ रक्त वाहिकाओं (20 माइक्रोन व्यास) से पता चलता है छवि विश्लेषण से पता चलता है कि आरोपण के बाद 4 सप्ताह, कई कैंसर पिंड का गठन कर रहे हैं. वे फेफड़ों की मात्रा (17%) का एक महत्वपूर्ण अंश को कवर कर रहे हैं. फेफड़े धुंधला ट्यूमर के परिधीय क्षेत्रों में पाया गया था. गौरतलब है, के रूप में अंजीर 4B में दिखाया गया है, कई रक्त वाहिकाओं मौजूद पिंड के अंदर भी कर रहे हैं कवर प्रारंभिक विश्लेषण करने के लिए उनकी मात्रा के कुछ 3% के अनुसार.

चित्रा 4 कैंसर पिंड के 3D छवि एक चूहे में बढ़ रहा है.फेफड़ों. मात्रा प्रतिपादन (ए) और मात्रा (बी) के माध्यम से एक अनुभाग के एक स्नैपशॉट दिखाए जाते हैं. कैंसर पिंड तीर के साथ चिह्नित हैं.

मूवी 1. चित्रा 1 में माउस फीमर के वॉल्यूम प्रतिपादन. लिए यहाँ क्लिक करें फिल्म देखने.

मूवी 2. चित्रा 2 में चूहे फेफड़ों के वॉल्यूम प्रतिपादन. लिए यहाँ क्लिक करें फिल्म देखने.

मूवी 3 फेफड़ों के माध्यम से सीरियल वर्गों. पिंड स्लाइस की अधिकांश में ग्रे क्षेत्रों के रूप में दिखाई देते हैं. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

भ्रूण 18.5 दिन (E18.5) C57/Bl6 माउस खनिज प्रक्रिया के दीक्षा के बाद चार दिन है. विकास के इस स्तर पर, भविष्य हड्डी mineralized osteoids के कई परतों का बना है, 3 चित्र में स्पष्ट रूप से देखा. इस बिंदु पर, एक तनाव चाहिए कि mineralized ऊतकों विभिन्न उपकरणों के साथ जो कम नमूना से निपटने की आवश्यकता कम संकल्प पर visualized किया जा सकता है. उच्च संकल्प प्रदान करने के अलावा वर्तमान प्रोटोकॉल (और सूक्ष्म सीटी साधन में यह प्रयोग किया जाता), माप के लिए सबसे अच्छा ज्यामितीय मापदंडों का चयन करने के लिए उपयोगकर्ता के लिए उच्चतम लचीलापन प्रदान करता है.

4 छवि में परिणाम बताते हैं कि orthotopic फेफड़ों के कैंसर के पशु मॉडल में, मानव गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर रक्त वाहिकाओं और neovascularization की भर्ती प्रेरित कर सकते हैं. हम विचार है कि फेफड़े के ऊतकों न तो ले जाया गया था, और न ही इसके आकार माप के दौरान बदल गया है. उपयोगकर्ता विशेष सावधानी बरतने के लिए एक टोमोग्राफी के दौरान इस तरह के बदलाव से बचना चाहिए. कुछ नमूने के लिए, विशेष रूप से नरम ऊतक के लिए, एक विशेष पकड़े उपकरणों है कि माप के दौरान पूरी तरह से नमूना स्थिर निर्माण किया है. दुर्भाग्य से ट्यूमर के आसपास में विपरीत एजेंट की उच्च चोरी की उपस्थिति परिधीय रक्त वाहिकाओं के विश्वसनीय मात्रा का ठहराव को रोका. कुछ धुंधला हो जाना एजेंट के द्वारा एक परिणाम के रूप में छवियों किनारों पर विशेष रूप से दागी हैं, जो स्पष्ट रूप से फिल्में 2 और 3 में मौजूद है. हम यह फैल नहीं रोकने के लिए, लेकिन उनके आकार, आकृति और भीतर रक्त वाहिकाओं की उपस्थिति सहित कैंसर पिंड, के बारे में उपयोगी जानकारी प्रभावित नहीं था सकता है. हम स्पष्ट रूप से निष्कर्ष है कि ब्रोन्कियल परिसंचरण है जो यहाँ का अध्ययन किया गया था के लिए कम से कम, परिधीय रक्त की आपूर्ति ट्यूमर छिड़काव में भाग लेता है, कुछ छिड़काव के साथ भी ट्यूमर के अंदर मौजूद सकता है.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

अध्ययन इरविंग और Cherna Moskowitz के Weizmann विज्ञान संस्थान में नैनो और जैव नैनो इमेजिंग के लिए केंद्र में आयोजित किया गया.

हम डिजाइन और इस प्रोटोकॉल में चल रहा है उसकी मदद के लिए orna Yeger के लिए आभारी हैं.

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