הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

זרימת עבודה בסיסיים להדמיה של אקטין Dynamics במהלך שחול תא האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

האפידרמיס של דג הזברה מתפתח מורכבת משתי שכבות נפרדות, שכבת פני השטח (או periderm) לבין שכבת הבסיס של התאים ליצור קשר עם קרום המרתף ^2. התאים של שכבת פני השטח החיצוניים עוברים אפופטוזיס ו מסולקות מן הרקמה על ידי שחול ³ (איור 1). כדי להמחיש את התהליך הזה בזמן אמת, אנו מזריקים RNA קידוד חלבון פלואורסצנטי אדום התמזגו לתחום הומולוגיה calponin של utrophin, החלבון אקטין מחייב (RFP-UtrCH) ^4,5, לאחד תאים דג הזברה הבמה מהונדס המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP ) תחת מרובדת epithelia האמרגן cytokeratin 8 ⁶ (איור 2 א). למרות RFP-UtrCH מתבטא בכל מקום בגוף של בעלי חיים לאחר הזרקת RNA, אנו מתמקדים בתאי האפידרמיס שטחית המבטאים הן RFP ו-GFP לעקוב אקטין הדינמיקה במיוחד האפידרמיס (תרשים 2B). לאחר מכן, אנו לטיפול הזחלים עם G418 לגרום שחול תאים אפופטוטיים התמונה ואת האפידרמיס סיבי אקטין באמצעות מיקרוסקופ דיסק ספינינג confocal ולרכוש מערכי נתונים 4D.

לפני התחלת הניסוי

1. במבחנה לתמלל את RNA מתבנית DNA לינארית באמצעות mMachine mMessage SP6 Kit (Ambion) ולטהר את RNA כתרים באמצעות RNeasy Mini Kit (Qiagen). לדלל את RNA ל ~ 60ng/ul באמצעות מים סטריליים, להפוך 3-5μl aliquots ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן להזרקה. הערה: הימנע להקפיא חוזרות / הפשרה על מנת למנוע הידרדרות של רנ"א.
2. להכין תבנית להחזיק את העוברים במהלך ההזרקה ידי שפיכת 40mL agarose של 2% בטווח הבינוני העובר E3 (E3) לתוך צלחת 100 x 15mm תרבות ומיקום תבנית microinjection (Adaptive כלי המדע, # I-34) במגש הזה. לאחר agarose יש הקרושה, להסיר את התבנית כדי לחשוף את שקתות ב agarose. אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
3. משוך נימי מחטים להזרקה באמצעות זכוכית בורוסיליקט עם חוטים (OD 1.0mm, מזהה 0.78, אורך 10 ס"מ) ו פולר P-97 סאטר פיפטה את ההגדרות הבאות (חום 485, משוך 50, מהירות 60, עיכוב / שעה 90, בלחץ 200 ). הערה: סוגים שונים של זכוכית ידרוש אופטימיזציה של התנאים המנויים.
4. מאפרים 1% נמוכה ממיסים (LM) agarose ב-E3 ולאחסן 1mL aliquots על 42 ° C. היזהר כמו אידוי של E3 מן המניות יכולים להגדיל את ריכוז agarose.
5. שמור על דג הזברה מבוגר בתנאי מעבדה סטנדרטיים, עם קבוע אור / חושך מחזור של 14 שעות אור ו 10 שעות חושך ^7. בלילה שלפני הניסוי להגדיר דגים להזדווג על ידי הנחת 3 נשים ו -2 גברים בטנק מופרדים על ידי מחיצה. למחרת בבוקר, להחליף את המים במיכל ולמשוך את המחיצה כאשר האורות נדלקים.

1. הזרקת RNA קידוד החלבון אקטין Tagged fluorescently הכבילה

1. ההפשרה RNA על הקרח. הוסף האדום פנול 0.5% ל RNA ביחס של 1:1 עבור ריכוז RNA הסופי של ~ 30ng/μl עומס פתרון 1μl לתוך מחט נימי רתומה גב מילוי.
2. איסוף ~ 75 1 ^8-cell בשלב CK: עוברים GFP ב-E3. Pipet pipet שנאספו עוברים לתבנית microinjection עם 5 ¾ פסטר בעדינות לכוון את העוברים בשוקת עם FST דומון # 5 מלקחיים. הערה: הקפד לעבוד מהר, כדי למנוע הזרקת לעובר רב תא הבמה, אשר עלולה לגרום ביטוי פסיפס של RNA מוזרק.
3. תחת stereomicroscope מעבדה סטנדרטי לנתח, להזריק את הרנ"א בחלמון של עוברי באמצעות לחץ שבשליטת microinjector (הרווארד Apparatus PLI-100 Pico-Injector). נקודה אדומה (אדום פנול) צריך להיות גלוי העובר לאחר ההזרקה. הזרק לפחות 50 עוברי עבור כל ניסוי. (ראה פרוטוקול יופיטר הקודם עבור פרוטוקול מפורט על הזרקת RNA לתוך עוברי דג הזברה ^9). הערה:
   1. נפח של ~ 2nl אמור לשמש עבור הזרקה של רנ"א לתוך אחד התאים עוברים שלב. כדי לקבוע את כמות הרנ"א מוזרק, לוותר בולוס של רנ"א לתוך טיפה של שמן מינרלי בשקופית מיקרומטר מכויל או תחת מיקרוסקופ עם בר סולם מובנית מהעיניות. טיפה של רנ"א צריך להיות כדור מושלם. לחשב את הסכום מועברת באמצעות המשוואה: כרך (ב nl) = 4/3πr ^3. התאמת עוצמת השמע מועבר על ידי שינוי בלחץ ההזרקה או זמן על המכשיר.
   2. טיפול צריך גם לקחת להזרים את הסכום הנמוך ביותר של רנ"א המאפשרת ויזואליזציה של fluorophore, כמו ריכוז גבוה של RNA יכול להיות רעיל העובר המתפתח. כדי לקבוע רמת ביטוי הולם, בניסוי במינון עקומת יש לבצע לפני הפעלת הניסוי. </ Li>
4. מיין עוברים להסיר כל הביצים מופרית או פגום ומקום כל העוברים הנותרים ב 28.5 ° C.
5. לאחר 24 שעות, השתמש במיקרוסקופ לנתח ניאון כדי לבחור עוברי דג הזברה, כי יש רמה גבוהה של GFP (האפידרמיס) ו RFP (אקטין) פלואורסצנטי. מניחים את העוברים שנבחרו 28.5 ° C עד מוכן להמשיך עם הטיפול התרופה לגרום אפופטוזיס.

2. אינדוקציה של שחול תא הזחלים דג הזברה באמצעות G418

מצאנו כי החשיפה לאנטיביוטיקה aminoglycoside G418, או Geneticin, גורם לאפופטוזיס ו שחול של תאים אפידרמיס בפיתוח הזחלים דג הזברה ³ על ידי מנגנון בלתי ידוע. חשוב לציין כי טיפול זה עובד רק על זחלים, כי הם 4 ימים הפריה פוסט ומעלה. אנו מוצאים כי ~ 5-25 תאים ניתן למצוא extruding בכל זמן נתון מתוך סנפיר אפיתל של דג הזברה G418 הזחל טיפול. כאשר כמות תאים אפופטוטיים extruding יכול לנוע בין דגים דגים, אנו ממליצים הרכבה דגים מרובים עבור הדמיה.

1. איסוף מקום 4 שלאחר יום הפריה (DPF) הזחלים דג הזברה בתערוכה הן GFP ו RFP הקרינה לתוך צלחת 35 x 10mm תרבות המכילה 3 מיליליטר (MLS) של E3. אפשר לטפל עד 25 זחלים בצלחת תרבות זו גודל.
2. בזהירות להחליף את התקשורת עם 3mLs של 1mg/mL המכיל E3 של הזחלים G418 ו מדגירים את התרופה במשך 4 שעות ב 28.5 ° C. שים לב G418 אור רגיש, כל כך דואגים לשמור על תרבות צלחת מכוסה או בחושך.
3. הסר התקשורת ולהחליפו מראש חימם 28.5 ° C-E3 מדיה המכילה Tricaine 0.02% והמשך הרכבה הזחלים.

3. דג הזברה הזחלים הרכבה עבור הדמיה

1. העברת 3 זחלים אל צינור 1.5 Eppendorf מ"ל ולהסיר ביותר של E3 לאחר הכיור דגים לתחתית של התחתית. מצאנו כי עד 3 חיות יכול להיות מותקן כראוי לפני agarose מתמצק.
2. בעזרת קצה pipet לחתוך, 120ul pipet של 1% LM-agarose (42 ° C) לתוך הצינור, לערבב, ואז בעדינות pipet הזחלים תערובת agarose על coverglass בתחתית של צלחת תרבות MatTek.
3. באמצעות בעל פין FST בסיכה להוסיף או טונגסטן מחט מחוברת, במהירות לכוון את הזחלים ולכן הם ישר ושטוח נגד coverglass של המנה MatTek.
   הערה: אנו משתמשים בדרך כלל סיכה ישר לכוון הראשון הזחלים ואז סיכה בצורת האות כדי לוודא שהם שטוח נגד coverglass תוך מניעת נזק דגימות.
4. לאחר agarose יש הקרושה, בעדינות למלא את המנה עם E3 המכיל 0.02% Tricaine. הערה: לחילופין, G418 ניתן להוסיף E3 בצלחת הדמיה להמשיך שחול זירוז, אם כי לטווח ארוך חשיפה 1mg/mL G418 יהרוג את הזחלים.

4. הדמיה חיה של אקטין דינמיקה הפרט התנהגויות תא אפיתל במהלך שחול נייד באמצעות מיקרוסקופ דיסק ספינינג Confocal

מצאנו כי את כל התהליך של שחול תא אפופטוטיים מן האפידרמיס של דג הזברה מתפתח הזחלים לוקח כ 20 דקות ^3. כאן אנו מדגימים כיצד הגדרת ניסוי זמן לשגות הדמיה לאסוף סדרה של מטוסים z דרך שכבה יחידה של האפידרמיס דג הזברה כדי להמחיש את התהליך שחול. מצאנו כי טיפוסי מיקרוסקופים widefield ניאון גורם משמעותי photobleaching של סיבי אקטין ואינם מאפשרים הדמיה timelapse. לכן, כדי למקסם את ההחלטה שלנו ולמנוע photobleaching, אנו משתמשים במיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. להלן נתאר כיצד להגדיר את הניסוי באמצעות תוכנת IQ אנדור עם מיקרוסקופ ניקון, אם כי העקרונות שנדונו ניתן ליישם מיקרוסקופ דומה בחר קופצים.

1. ראשית, להפעיל את ארגון (עבור עירור של ה-GFP ב 488nm) ו HeNe (עבור עירור של RFP ב 561nm) לייזרים, מיקרוסקופ, מצלמה מנורה epifluorescent.
2. בתוך IQ אנדור תוכנה (גרסה 1.10.1), ליצור סדרה זמן פרוטוקול המכיל את אורכי הגל אתה רוצה תמונה, בתדירות של המרווחים בין לוכדת תמונה מספר פעמים ללכוד יש לחזור.
3. בעדינות במקום צלחת MatTek המכיל הדגימה שלך על הבמה מיקרוסקופ ולהשתמש מטרה 20x עם האור המועבר להתמקד הזחלים.
4. העבר את המים 40X טבילה אובייקטיבי (NA 0.8) לתוך המיקום הנכון. שימוש למטרה זו, אנו יכולים הסרט כ 20-25 תאים לכל שדה, אשר מאפשר לנו לעקוב אחר התנהגויות הסלולר במהלך שיחול בעוד גם לפתרון המשנה הסלולר דינמיקה אקטין. הערה: הרכבה זהה ואסטרטגיות הדמיה יכול להיות מיושם על מיקרוסקופים זקופה, אם כי טבילה במים 40X אובייקטיבי עם מרחק עבודה ארוך יש להשתמש.
5. בזהירות במקום טיפת מים על החלק העליון של היעד במהירות 40X במקום צלחת MatTek על העליונה. לאדואר: Zeiss פתרון Immersol טבילה יכול לשמש גם אם אידוי של המים היא בעיה.
6. זהה את הדגימה באמצעות שלב או הארה DIC ולאחר מכן להשתמש epifluorescence 488nm להתמקד דווקא על האפידרמיס GFP חיובית.
7. מעבר למצב סריקה confocal. התאם את עוצמת הלייזר וזמן החשיפה לכל אחד הערוצים (488nm ו 561nm) בהתאם. תשמרי על עצמך כדי לאזן את כוח לייזר וזמן החשיפה לגילוי אופטימלי של האות שלך כדי למנוע כל photobleaching או רעילות.
8. כדי לזהות תאים extruding, להשתמש epifluorescence לדמיין GFP שכותרתו האפידרמיס לזהות קבוצה של תאים דפוס שושנת הקלאסי, המורכב מאוסף של תאים סביב תא עגול קטן באמצע. שימוש במצב סריקה confocal, שם צריך להיות גם הצטברות של אקטין המכרז שכותרתו נראה כמו טבעת סביב התא עגול קטן באמצע, סימן ההיכר של שחול התא. לאחר שזיהית תא extruding, להגדיר במהירות את המיקרוסקופ לרכוש 4D (XYZ-Time) מערכי נתונים confocal.
9. הגדר את נקודות העליונים והתחתונים בתוך המטוס z לדמיין שכבה יחידה של האפידרמיס, כולל תא extruding, ובחר את גודל הצעד. במשך זמן לשגות הדמיה, לקבוע את המרווחים עבור לכידת תמונה ומספר חזרות. לדוגמה, אנו בדרך כלל לרכוש סדרה Z-5-פורש 10μm, עם גודל 1 מיקרומטר צעד, כל 1-2 דקות במשך 30 דקות.
10. כדי להציג את הנתונים, אנחנו בדרך כלל עושים את 3-D התחזיות של הסדרה z ולשמור את הנתונים להגדיר כקובץ סרט התואם מהיר זמן (Apple). באופן זה, אנו יכולים לדמיין התכווצות של טבעת אקטין והתנהגויות אפיתל המתרחשים סביב התא למות לאורך זמן.

5. נציג תוצאות

באיור 1. סכמטי של תא שחול אפופטוטיים. סיבי אקטין מוצגים באדום, GFP אפידרמיס התאים החיוביים הם ירוקים.

איור 2. זרימת עבודה ניסויית. א סכמטי של זרימת העבודה עבור הניסוי. B. הביטוי של RFP-UtrCH באפידרמיס של CK 4dpf: GFP דג הזברה.

איור 3. עדיין במסגרות (z-תחזיות) מתוך הסרט זמן לשגות העוקב לחיות אקטין הדינמיקה במהלך תהליך של שחול תא אפיתל. חצים מציינים את טבעת של אקטין נוצר על ידי תאים שכנים אשר חוזים וסוגר במשך 2 דקות.

פרוטוקול המתואר כאן מדגים שיטה פשוט וברור כדי להמחיש את התהליך של שחול ברקמות האפיתל לחיות. סוג זה של הניסוי מאפשר לנו לבחון את הדקויות של אקטין דינמיקה לא העריכו בעבר מנתח רקמות קבוע, ולכן, משלים שיטות immunofluorescent משותף. אנו יכולים להשתמש בפרוטוקול זה בשילוב עם מעכבי כימיים או מוטציות גנטיות טוב יותר לנתח את התהליך שחול ומחלות קובע מחקר הקשורים לכישלון להסיר תאים אפופטוטיים ברור, אשר אנו מצפים שיוביל תגובות דלקתיות או הצטברות של תאים פגומים, כמו לראות סרטן. לדוגמה, המעבדה שלנו הראתה בעבר כי מעכבי הכימי ניתן להשתמש בשילוב עם G418 כדי לשנות את המיקוד של סיבי אקטין פני השטח basolateral של התא, המשפיע בכיוון תא מוציא ^3. מגבלה אחת השיטה הנוכחית היא כי בשל אופי אקראיים ובלתי צפוי של מוות של תאים, נתונים שלנו נוטים להתמקד בשלבים מאוחרים יותר של שחול. כדי לחקור את היווצרות של טבעת אקטין תאיים וייזום של התכווצות, בניסויים עתידיים יחולו טכניקות כדי לעורר אפופטוזיס משנה של תאים אפיתל fluorescently שכותרתו המוכוונות גנטית של מוות של תאים ^10. שילוב של אסטרטגיה זו השיטה שלנו לתמונה אקטין הדינמיקה האפידרמיס להקל מחקרים הצעדים הראשונים המובילים שחול תאים אפופטוטיים. יחד, המידע שנצבר בניסויים אלה יוסיפו משמעותית להבנת שחול תא אפיתל המשמעות הרפואית שלה.