Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

Fluxo básico para a visualização de Actina Dynamics durante a extrusão celular na epiderme Zebrafish desenvolvimento

A epiderme do peixe-zebra em desenvolvimento é composto de duas camadas distintas, a camada de superfície (ou periderme) e uma camada basal de células que o contato da membrana basal ^2. As células da camada de superfície externa sofrem apoptose e são eliminados a partir do tecido por extrusão ³ (Figura 1). Para visualizar este processo em tempo real, injetamos RNA codificação de proteínas fluorescentes vermelhas fundida ao domínio de homologia calponin de utrophin, uma proteína de ligação de actina (RFP-UtrCH) ^4,5, em uma única célula-estágio zebrafish transgênicos expressando a proteína fluorescente verde (GFP ) sob o epitélio estratificado promotor citoqueratina 8 ⁶ (Figura 2A). Embora RFP-UtrCH é onipresente expressa no animal após a injeção de RNA, vamos nos concentrar nas células superficiais da epiderme, que expressam tanto RFP e GFP para seguir actina dinâmica especificamente na epiderme (Figura 2B). Em seguida, tratar as larvas com G418 para induzir a extrusão celular por apoptose e imagem os filamentos de actina epiderme e usando um microscópio confocal disco giratório e adquirir conjuntos de dados 4D.

Antes do início do experimento

1. In vitro transcrever o RNA a partir de um modelo de DNA linearizado usando o mMessage mMachine SP6 kit (Ambion) e purificar o RNA capped usando o RNeasy Mini kit (Qiagen). Diluir o RNA para ~ 60ng/ul usando água estéril, fazer 3-5μl alíquotas e armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para a injecção. Nota: Evite congelar repetitivos / descongelamento para evitar a degradação do RNA.
2. Fazer um molde para segurar os embriões durante a injeção por vazamento 40mL de agarose 2% em meio embrião E3 (E3) em uma placa de cultura 100 x 15mm e colocar um molde de microinjeção (Ferramentas Adaptive Ciência, # I-34) neste tabuleiro. Uma vez que a agarose solidificou, remover o molde para expor os bebedouros na agarose. Armazenar a placa a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
3. Puxar agulhas para injeção capilar utilizando vidro de borosilicato com filamentos (OD 1.0mm, ID 0,78, 10cm) e um Sutter Puller Pipetar P-97 em as seguintes configurações (Heat 485, Pull 50, Velocity 60, Delay / Time 90, Pressão 200 ). Nota: Diferentes tipos de vidro exigirá otimização das condições listadas.
4. Compõem 1% Low Melt (LM) em 1mL agarose alíquotas E3 e armazenar a 42 ° C. Tenha cuidado, pois a evaporação da E3 dos estoques pode aumentar a concentração de agarose.
5. Manter peixe-zebra adulto em condições de laboratório padrão, com um regular ciclo claro / escuro de 14 horas luz e 10 horas de escuridão ^7. A noite antes do experimento configurado peixes para acasalar, colocando três fêmeas e dois machos em um tanque separado por uma divisória. Na manhã seguinte, trocar a água no tanque e puxar o divisor quando as luzes se acendem.

1. Injeção de RNA codifica a proteína actina fluorescente Tagged Binding

1. Descongelar o RNA no gelo. Adicionar 0,5% de fenol vermelho para o RNA em uma proporção de 1:1 para uma concentração final de RNA ~ 30ng/μl e carga solução 1μl em uma agulha puxado capilar por volta de enchimento.
2. Coletar ~ 75 1 célula-stage ⁸ CK: embriões GFP na E3. Pipeta coletadas de embriões no molde microinjeção com uma pipeta Pasteur 5 ¾ e gentilmente orientar os embriões no cocho com FST Dumont # 5 fórceps. Nota: Tome cuidado para trabalhar com rapidez para evitar injetar um embrião palco multi-celular, o que pode resultar na expressão mosaico da RNA injetado.
3. Sob um estereomicroscópio padrão de laboratório de dissecação, injetar o RNA para a gema dos embriões usando um microinjetor pressão controlada (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-Injector). A mancha vermelha (vermelho de fenol) devem ser visíveis no embrião após a injeção. Injetar pelo menos 50 embriões para cada experimento. (Veja o protocolo JOVE anterior para um protocolo detalhado sobre RNA de injeção em embriões de peixe-zebra ^9). Nota:
   1. Um volume de ~ 2nl deve ser usado para injeção de RNA em uma célula de embriões palco. Para determinar a quantidade de RNA injetado, dispensar um bolo do RNA em uma gota de óleo mineral em um micrómetro calibrado ou sob um microscópio com uma barra de escala construída pelas oculares. A gota de RNA deve ser uma esfera perfeita. Calcule a quantidade entregue usando a equação: Volume (em nl) = 4/3πr ^3. Ajustar o volume entregue, alterando a pressão de injeção ou o tempo no instrumento.
   2. Cuidados também devem ser tomadas para injetar a menor quantidade de RNA que permite a visualização do fluoróforo, como altas concentrações de RNA podem ser tóxicos para o embrião em desenvolvimento. Para determinar o nível de expressão apropriada, um experimento de dose-curva deve ser feita antes de executar o experimento. </ Li>
4. Classificar os embriões para remover quaisquer ovos não fertilizados ou danificados e colocar todos os embriões restantes de 28,5 ° C.
5. Após 24 horas, use um microscópio de fluorescência de dissecação para selecionar embriões zebrafish que têm um alto nível de GFP (epiderme) e fluorescência RFP (actina). Coloque os embriões selecionados em 28.5 ° C até que esteja pronto para prosseguir com o tratamento medicamentoso para induzir a apoptose.

2. Indução de extrusão celular em larvas do peixe usando G418

Descobrimos que a exposição aos antibióticos aminoglicosídeos G418, ou Geneticin, faz com que a apoptose e extrusão de células epidérmicas no desenvolvimento de larvas do peixe ³ por um mecanismo desconhecido. Importante, esse tratamento só funciona em larvas que são 4 dias após a fertilização e mais velhos. Vemos que ~ 5-25 células podem ser encontradas extrusão, em determinado momento da fin epiteliais G418 zebrafish tratados larval. Como a quantidade de células apoptóticas extrusão pode variar de peixe para peixe, recomendamos a montagem de peixe múltiplas para imagem.

1. Recolher e colocar 4 fertilização pós-dia (dpf) larvas de peixe-zebra exibindo tanto GFP e RFP fluorescência em uma placa de cultura 35 x 10mm contendo três mililitros (ml) da E3. Pode-se tratar até 25 larvas em cultura este prato tamanho.
2. Recolocar cuidadosamente os meios de comunicação com 3mls de 1mg/mL contendo E3 de G418 e incubar larvas na droga durante 4 horas a 28,5 ° C. Note-se que G418 é sensível à luz, por isso tome cuidado para manter o prato de cultura, recobertos ou no escuro.
3. Remova a mídia e substituir com pré-aquecido 28,5 ° C media E3 contendo tricaina 0,02% e proceder à montagem das larvas.

3. Larvas Zebrafish montagem for Imaging

1. Transferência de três larvas para um tubo eppendorf 1,5 ml e remover a maioria da E3 após o dissipador de peixe até o fundo do tubo. Descobrimos que até 3 animais pode ser montada corretamente antes da agarose solidifica.
2. Usando a ponta da pipeta corte, 120ul pipeta de 1% LM-agarose (42 ° C) dentro do tubo, misturar, e então suavemente pipeta as larvas e mistura de agarose para a lamínula no fundo de um prato de cultura Mattek.
3. Usando um titular FST pino com um pino de inserção ou de tungstênio agulha acoplada, de forma rápida orientar as larvas para que eles estão em linha reta e plana contra a lamela do prato Mattek.
   Nota: Normalmente usamos um alfinete para orientar o primeiro larvas e, em seguida, um pino em forma de L para garantir que eles são planas contra a lamela, evitando danos aos espécimes.
4. Uma vez que a agarose solidificou, gentilmente encher o prato com E3 contendo 0,02% tricaina. Nota: Como alternativa, G418 pode ser adicionado à E3 no prato de imagem para continuar a extrusão de indução, apesar de longo prazo da exposição a 1mg/mL G418 vai matar as larvas.

4. Imagens ao vivo de Actina Dynamics and Individual Comportamentos de células epiteliais durante a extrusão celular usando um Microscópio Confocal Spinning Disc

Nós descobrimos que todo o processo de extrusão de células apoptóticas da epiderme de desenvolvimento de larvas do peixe leva aproximadamente 20 minutos ^3. Aqui demonstramos como configurar uma experiência de imagens de lapso de tempo para coletar uma série de planos z através de uma única camada da epiderme zebrafish para visualizar o processo de extrusão. Descobrimos que microscópios fluorescentes típicas Widefield causa significativa fotodegradação dos filamentos de actina e não permitem imagens timelapse. Portanto, para maximizar a nossa resolução e prevenir a fotodegradação, nós usamos um microscópio confocal disco giratório. Abaixo descrevemos como configurar o experimento usando o software de QI Andor com um microscópio Nikon, embora os princípios discutidos podem ser aplicadas para microscópio semelhante set-ups.

1. Primeiro, ligue o Argon (para excitação do GFP em 488nm) e HeNe (para excitação do RFP em 561nm) lasers, microscópio de câmara, e lâmpada de epifluorescência.
2. Dentro do IQ Andor software (versão 1.10.1), criar um protocolo de séries temporais contendo os comprimentos de onda que você quer para a imagem, a freqüência dos intervalos entre captura de imagem eo número de vezes a captura deve ser repetido.
3. Delicadamente, coloque o prato Mattek contendo o seu exemplar no palco e usar um microscópio 20x objetivo com luz transmitida para focar as larvas.
4. Mover a objetiva de imersão 40X de água (NA 0,8) para a posição correta. Usando este objectivo, podemos filme aproximadamente 20-25 células por campo, o que nos permite seguir comportamentos celulares durante a extrusão e ao mesmo tempo resolver dinâmica sub-celular de actina. Nota: A montagem mesmo e estratégias de imagem pode ser aplicada a microscópios de pé, apesar de uma objetiva de imersão 40X de água com uma longa distância de trabalho deve ser usado.
5. Com cuidado, coloque uma gota de água no topo da objetiva de 40x e colocar rapidamente o prato Mattek por cima. Nãoe: Zeiss solução de imersão Immersol também pode ser usado se a evaporação da água é um problema.
6. Identificar a amostra, utilizando fase ou iluminação DIC e use epifluorescência 488nm a concentrar-se especificamente sobre a epiderme GFP positivas.
7. Alternar para o modo de varredura confocal. Ajustar a intensidade do laser e do tempo de exposição para cada um dos canais (488nm e 561nm) em conformidade. Tome cuidado para equilibrar a potência do laser eo tempo de exposição ideal para a detecção do sinal e impedir qualquer fotobranqueamento ou toxicidade.
8. Para identificar as células de extrusão, use epifluorescência para visualizar a GFP rotulados epiderme e identificar um grupo de células em um padrão clássico de roseta, que consiste em um conjunto de células em torno de uma pequena cela redonda no meio. Usando o modo de varredura confocal, também deve haver um acúmulo de actina RFP marcado visível como um anel em torno da célula pequena e redonda no meio, uma marca de extrusão celular. Depois de ter identificado uma célula de extrusão, configurar rapidamente o microscópio para adquirir 4D (XYZ-Time) datasets confocal.
9. Definir os pontos superior e inferior dentro do plano z para visualizar uma única camada da epiderme, incluindo a célula de extrusão, e selecione o tamanho do passo. Por lapso de tempo de imagem, definir os intervalos para captura de imagem eo número de repetições. Por exemplo, nós tipicamente adquirir um z-series abrangendo 5 10μm, com um tamanho do passo 1 mícron, a cada 1-2 minutos para 30 minutos.
10. Para visualizar os dados, que normalmente fazem projeções 3-D da série z e salvar o conjunto de dados como um arquivo de filme que é compatível com o Quick Time (Apple). Desta forma, podemos visualizar a contração do anel de actina e comportamentos epiteliais que ocorrem em torno da célula morrendo ao longo do tempo.

5. Resultados representante

Figura 1. Esquemático de extrusão celular por apoptose. Filamentos de actina são mostrados em vermelho, GFP positivas células epidérmicas são verdes.

Figura 2. Fluxo de trabalho experimental. A. Esquema do fluxo de trabalho para o experimento. B. Expressão de RFP-UtrCH na epiderme de um CK 4dpf: GFP zebrafish.

Figura 3. Ainda frames (z-projeções) de um filme de lapso de tempo que se segue ao vivo actina dinâmica durante o processo de extrusão de células epiteliais. Setas indicam o anel de actina formado por células vizinhas que os contratos e fecha durante o curso de 2 minutos.

O protocolo aqui descrito demonstra um método simples e direta para visualizar o processo de extrusão em um tecido vivo epiteliais. Este tipo de experimento nos permite examinar sutilezas de actina dinâmica antes não apreciada em análises de tecido fixado, e, portanto, complementa métodos comuns de imunofluorescência. Podemos usar este protocolo, em combinação com inibidores químicos ou mutantes genéticos para analisar melhor o processo de extrusão e estados de doença estudo associado à falha de remover e limpar células apoptóticas, que esperamos vai levar a respostas inflamatórias ou o acúmulo de células danificadas, como visto no câncer. Por exemplo, nosso laboratório já havia mostrado que os inibidores químicos podem ser usados ​​em combinação com o G418 para alterar o direcionamento dos filamentos de actina ao longo da superfície basolateral da célula, que os efeitos da direção de uma célula extrudes ^3. Uma limitação do método atual é que, devido à natureza estocástica e imprevisíveis de morte celular, os nossos conjuntos de dados tendem a se concentrar nas etapas posteriores da extrusão. Para estudar a formação do anel de actina multicelulares e início da contração, futuros experimentos serão aplicadas técnicas para induzir a apoptose em um subconjunto de fluorescência marcado com células epiteliais que são geneticamente direcionados para a morte celular ^10. Combinando essa estratégia com o nosso método de imagem dinâmica de actina na epiderme deve facilitar os estudos dos primeiros passos levando a extrusão celular por apoptose. Juntas, as informações obtidas a partir desses experimentos vai aumentar significativamente a nossa compreensão de extrusão de células epiteliais e sua importância médica.