אפיון מבודד, מאוורר ריאות, instrumented ועכבר perfused עם תזרים pulsatile

בפרוטוקול הזה אנחנו מדגימים מבודד, מאוורר, עכבר perfused ריאות הכנה אשר שימשו בעבר כדי לכמת את ההשפעה של תסחיפים ריאתי היפוקסיה כרונית על pulsatile לחץ ריאתי זרימה יחסים וסקולרית (Tuchscherer, וובסטר, & צ'סלר, 2006; Tuchscherer ואח' . 2007). בקיצור, הריאות עכבר מבודדים בניתוח מן הרקמות הסובבות, ממוקם חדר מחומם (IL-1; הרווארד Apparatus, Holliston, MA) ומאוורר (נשימתית Control Module (VCM)-R עם מודול נגד השעון (TCM); הרווארד Apparatus). Vasculature ריאות perfused עם מחומם בינוני RPMI 1640 תרבית תאים עם Ficoll 3.5% באמצעות משאבת מזרק (קול, בן הזוג, ורנון הילס, IL) כדי ליצור את גל זרימה קבועה או משאבה בתדירות גבוהה oscillatory (Bose-Electro חיל, עדן בערבה, MN) במקביל משאבת מזרק כדי ליצור pulsatile ריאתי כלי הדם לזרום גל. מתמרים ללחץ (P75, Apparatus הרווארד) למדוד את הלחץ המיידי עורק הריאה (PAP) ולחץ פרוזדורים שמאל (LAP). קצב הזרימה מיידיים (Q) נמדד עם מטר קו זרימה (Transonic Systems, Inc, באיתקה, ניו יורק). Pulsatile לחץ זרימה יחסים נגזרות מדידות אלה, אשר מספקים תובנה כלי דם ריאתי הפיזיולוגיה והפתולוגיה ו afterload חדרית הנכון.

1. ציוד:

1. ריאות בודדות הגדרת כולל מאוורר העכבר
2. נתוני מערכת רכישת מחשב עם LabVIEW התוכנית
3. שני הלחץ מתמרים ו flowmeter עבור זרימת perfusate
4. לחץ מתמר ו flowmeter (pnemotachometer) עבור זרימת האוויר
5. תדירות גבוהה משאבת מחשב oscillatory עם תוכנית מבחן Win
6. בום / זום, מיקרוסקופ מנורה
7. חימום אמבטיה עם משאבה תפוקה גבוהה למערכת IL-1

2. הכנת IL-1 מערכת

1. מים מזוקקים מחומם ל 37 מעלות צלזיוס על ידי באמבטיה חימום מופץ לתוך הפנים של מערכת IL-1.
2. כל משאבות, מתמרים ו IL-1 צינורית מחוברים באמצעות צנרת נקייה כל צינורות סמוקות עם מים מזוקקים מחומם ל 37 ° C. בועות האוויר, אשר יכול לנסוע לתוך הריאות ובצקת לגרום, יש להסיר. Tubing מהמשאבה תזרים oscillatory אל החיישן זרימת מן החיישן זרימת צינורית עורק ריאתי סמוקות עם PBS 1%.
3. P75 מתמרים ללחץ הם התביית על ידי סגירת שסתום אל הצינורית, פתיחת השסתומים לאווירה ואז ללחוץ על הכפתור לאפס אוטומטית על המגבר PLUGSYS. ואז, שסתום לאווירה סגור את שסתום אל הצינורית נפתחה.
4. היצירה נקבובי קרמיקה במסלול אוורור של מערכת IL-1 הוא הרטובות לספק לחות.

3. פתרונות

1. הכן 3.5% על ידי פתרון נפח Ficoll-RPMI ולסנן סטרילי התקשורת. סינון התקשורת מבטיח שאין חלקיקים גדולים שיכולים בשוגג embolize הריאה. שימוש בתקשורת סטרילי גם מקטין את הסבירות לפתח בצקת פתאומית בריאה. למלא את אחד 10 מ"ל מזרק עם RPMI לניתוח אחד 60 מ"ל מזרק עם RPMI למשפט כל הניסוי. מחממים את perfusate בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
2. הכן 1ml של הפרין במשקל הגוף 500IU/100g של העכבר (בקירוב). מלח הפרין הוא 158IU/mg. עבור עכבר ~ 25 גרם, מיקס 1.25 מ"ג מלח הפרין עם פתרון PBS 1ml בצינור microcentrifuge קטן.

4. איוורור עכבר

1. לאחר זריקה intraperitoneal של 150 מ"ג pentobarbital בפתרון לקילוגרם לתוך העכבר, להבטיח הרדמה עמוקה ידי ביצוע צביטה קשה על כפותיו. אם יש תגובה לא, להכין את העכבר לניתוח על ידי מצמיד רגליו הקדמיות שלה ללוח השעם ליציבות. הערה: במהלך הניסוי עומק ההרדמה מנוטרת בקפידה על ידי התבוננות בבעלי חיים. סיכות כפות חתכים תכופים לשמש גירוי מזיק, חוסר תגובה אשר מאשרת כי החיה נשאר במטוס כירורגית של הרדמה.
2. תרסיס החזה עם 95% אלכוהול כדי להרטיב את הפרווה להשתמש במלקחיים ישר לתפוס את העור בצוואר. חותכים 1 ס"מ פתח בעור באמצעות מספריים ישר.
3. לאחר החלק הפנימי של הצוואר חשוף, להסיר את כל רקמת הבלוטות לבן השריר השטחי, מחפש הוושט ואת קנה הנשימה. לבודד את הוושט ואת קנה הנשימה מרקמות של שני הצדדים בדיעבד.
4. הכנס את מלקחיים כפוף קטן תחת קנה הנשימה לבין לתפוס פיסת תפר בצד השני. משוך את תפר תחת קנה הנשימה לבין לקשור קשר רופף מנתחים. אין להדק את תפר או לקשור את הקשר.
5. גזור קטן בזווית "V" בתוך קנה הנשימה עם מספריים קטנים, לא לחתוך את כל הדרך דרך קנה הנשימה. הזז את לוח השעם ואת העכבר כדי IL-1 המחומם המערכת. שימוש שני מלקחיים בוטה, לתפוס את הצינורית קנה הנשימה ואת קנה הנשימה מתחת "v". ואז, להחליק את צינורית לקנה הנשימה לתוך הקנהEA באמצעות פתיחת "v". הדק את תפר סביב קנה הנשימה לבין צינורית לקנה הנשימה כדי לאבטח את הצינורית בתוך קנה הנשימה. לקשור את הקשר.
6. בגין אוורור (השראה 50%, 90 נשימות / דקה, עם השראה עמוקה) עם אוויר החדר.

5. המרוססת עכבר מאוורר

5.1. גש החדר הימני להזריק הפרין

1. החזה תרסיס עכבר עם אלכוהול שוב מחדש להרטיב את הפרווה. הסר את כל העור על החזה מעל הצלעות באמצעות מלקחיים ומספריים ישר ישר. חותכים לאורך עצם החזה כלפי מעלה. הרם את העור בכל צד ולאחר מכן לחתוך את העור בעקבות שורה של הצלעות התחתונות.
2. תפוס את תהליך xiphoid בחלק התחתון של עצם החזה עם פינצטה וחותכים חור הסרעפת באמצעות מספריים ישר. תפוס את הסרעפת עם פינצטה ופצע אותו מן הצלעות.
3. תפוס את תהליך xiphoid שוב עם פינצטה (יד שמאל) ולהשתמש כדור קצה, מספריים זווית לחתוך את החזה ואת דרך הצלעות, נזהר לא לחתוך את הריאות, הלב או כלי דם (שימוש כדור על קצה המספריים כדי להדריך אותך). לא יהיה דם אבל כל עוד את חוד החנית של המספריים היא נגד עצם החזה, הלב והריאות לא יהיה לחתוך.
4. תפוס את הצלעות בצד שמאל לחתוך כמה שיותר הצלעות כנדרש כדי לחשוף את הלב. לאט לאט להזריק את החדר הימני עם פתרון 0.1 מ"ל הפרין. שלב זה חשוב למניעת קרישי דם בריאה, אשר נזק לתאי האנדותל יפגע זלוף. הפרין חייב להיות מוזרק תוך הלב עדיין פועם.

5.2. Cannulate עורק הריאה הראשי

1. חותכים את שאר הצלעות (בצד שמאל וימין) באמצעות חזרה (מעוגל) סוף מלקחיים כדי לדחוף בעדינות את הריאות מהקיר הצלעות. תופס את הריאות עצמם תפגע הרקמה העדינה. קשר מקרי בין טיפים מספריים ואת רקמת הריאה גם לגרום לנזק.
2. הזז את המיקרוסקופ למקומו מעל הריאות. לחתוך את רקמת בלוטות שומן על גבי הלב. השתמש פינצטה כדי למשוך אותו מן העורקים והוורידים ואז לחתוך עם מספריים באביב תוך הרקמה נמצאת במתח.
3. באמצעות קבוצה נוספת הבוטה של ​​פינצטה, סקופ מימין לשמאל מהחלק העליון של הלב השמאלי תחת אטריום / החדר כדי לקבל את קצה פינצטה תחת אבי העורקים והעורק הריאתי (רש"פ). עשו זאת בזהירות, לא צריכה להיות התנגדות פינצטה. שימוש בוטה פינצטה מפחיתה את הסבירות בטעות ניקוב העורק הריאתי או אבי העורקים.
4. לאחר קצה פינצטה תחת האאורטה והרשות הפלסטינית, לתפוס פיסת תפר ולמשוך דרך. לקשור קשר מנתחים רופף. אין להדק את תפר או לקשור את הקשר.
5. אופציונלי: שימוש המספריים בזווית כדי להסיר את החלק התחתון של הגוף. צמצמו דרך הצלעות ועמוד השדרה; חיתוך אבי העורקים ואת הווריד הנבוב יגרום כמות משמעותית של דם לזרום - להשתמש Q-טיפ, לעצור את שטף. מניחים בתוך שקית לסילוק.
6. ראש הרשות הפלסטינית עם צינורית מ"ל 4 מתוך מזרק 10 מ"ל של RPMI. בדוק כי כל צנרת ללא בועות אוויר. זלוף של הריאות עם בועות מים מזוקקים או יגרום לבצקת.
7. חותכים חריץ קטן בקיר החדר הימני חופשי להכניס את הצינורית הרשות הפלסטינית, במטרה למטה מימין. קצה הצינורית צריך להיות גלוי דרך הקיר השקוף של הרשות הפלסטינית. להשרות כמות קטנה של RPMI כדי לאשר את המיקום שלך. הדק את תפר סביב האאורטה קנית, ואת הרשות לקשור את הקשר. שים לב כי בנקודה זו, אבי העורקים קשורה גם את כל כך זלוף בפועל לא צריך להתחיל עד אטריום שמאל cannulated.

5.3. Cannulate אטריום שמאל

1. חותכים חריץ בחלק התחתון של החדר השמאלי ואת אינרטי שמאל פרוזדורים (לוס אנג'לס) צינורית, מכוון כלפי מעלה. לחץ קל עשוי להיות נחוץ כדי לפתוח את שסתום צניפי בכיוון זה. במיקום הנכון, את קצה הצינורית יהיה לחמוק ולהיות בטוח ללא תפר.

5.4. בגין זלוף

1. ידנית להחדיר RPMI מתוך מזרק 10 מ"ל ב 0.3 מ"ל לדקה עד RMPI ניכרת בצינור יצוא (ורוד איש צבע בניגוד ברור PBS). אם אין זרימה בצינור יצוא העמדה מחדש, את הצינורית אנג'לס. אם לא יצוא ניתן להשיג עם מיצוב מחדש, לבדוק דליפת בעורק הריאה. דליפה או קרע בעורק הריאה לא ניתן לתקן, זה סיבה להפיל את הניסוי.
2. חבר מזרק 60 מ"ל של צינורית הרשות באמצעות מערכת IL-1 ולהתחיל עירוי 1ml/min של perfusate, בדיקת דליפות ולוודא הריאות להלבין, אשר מראה כי RPMI היא החלפת דם בריאות. Perfuse עם זרימה איטית במשך שתי דקות.

6. מדידת pulsatile ויציב לחץ ריאתי-Flow יחסים

1. עבור מחקרים זרימת pulsatile, להגדיר תחילה הבוכנה התקות oscillatory משאבת בביתהרמות הרצויות עבור כל תדר בתוכנית WinTest מבוסס על ניסויים קודמים. בשל השתנות במבנה הריאות ומכניקה, התקות צריכים להיות מותאמים עבור כל עכבר. הגדרת זרימה קבועה לרמה הרצויה. פתח את שסתום אל המשאבה oscillatory ולהתחיל נתונים הקלטה ממש לפני הפעלת פרופיל זרימה oscillatory (תוכנית Wintest). פתח את קובץ הנתונים העלילה זרימה ניסויית (Q) ב-Excel. התאם הבוכנה התקות oscillatory משאבת בתדר כל (תוכנית Wintest), כך ש max ו-Q דקות הם כרצונכם.
2. עבור ניסויים זרימה קבועה, כדי לסגור את שסתום המשאבה oscillatory. אם זה שסתום נותר פתוח, משאבה oscillatory מעשים כמו קבל, מלחלח את השינויים בקצב זרימת one למשנהו. איסוף נתונים במשך 10 שניות לפחות בקצב הזרימה או כל עד בלחץ הרשות הפלסטינית לא ישתנה על ידי למעלה מ -5%.
3. עבור מדידות זרימה או pulsatile או קבוע, אוורור ישן בלחץ קבוע לפני איסוף הנתונים. קורות חיים אוורור מיד לאחר איסוף הנתונים.
4. Watch עבור RPMI בצינור האוויר, זה עדות של בצקת היא סיבה להפיל את הניסוי. כמו כן, לא נותנים RPMI להגיע בלחץ האוויר או זרימה חיישנים כי זה יפגע מתמרים.

7. נציג תוצאות:

תוצאות יציב נציג:

בריאה מבודד הגדרת הניסוי יש את היכולת לשלוט באופן עצמאי, לא רק את זרימת ש ריאתי אלא גם לחץ האוויר P _האוויר שמאל LAP לחץ פרוזדורים. זהו יתרון משום ש, P _האוויר LAP להשפיע על כלי הדם הריאתי PAP שהתקבל בלחץ בעורק הריאה. יתרון נוסף הוא כי התוצאות המתקבלות אינן תלויות הטון מערכת העצבים הסימפתטית ^1, מעמד נפח הרדמה ^2.

שינויים PAP המושרה על ידי מדרגות צעד שינויים ש עבור קבוע P _אוויר קבוע או משתנה LAP מוצגים באיור 1. שים לב בהכנת ריאות מבודדים, LAP את הצינורית מחוברת בדרך כלל צינור שמנתב perfusate לתוך מיכל פסולת. עם צינור זה במקום, LAP תלויה מבחינה ליניארית Q עקב זרימת Poiseuille. עם זאת, בעיצומו של משקע מיכל פסולת ניתן להתאימם באופן ידני כדי לספק קבוע, שאינו אפס LAP או צינורות ניתן להסיר כדי לאפשר אפס LAP שאינו תלוי ש

תוצאות pulsatile נציג:

בעוד שרירותי גל תזרים pulsatile יכול להיות שנוצר עם מערכת זו, אנו בדרך כלל ליצור זרימה של הטופס ש = 3 + 2 חטא (2 ו πt) mL / min בתדרים של f = 1, 2, 5, 10, 15 ו - 20 הרץ על מנת להעריך את העכבה לינארית של vasculature הריאה (איור 2: הפאנל העליון). מתוך המדידות וכתוצאה מכך, PAP LAP ו-Q, עכבה ריאתי גודל כלי הדם (Z) ואת שלב (θ) מחושבים על ידי הראשון נרקבות מחזור אחד סינוסי מלא LAP-PAP ΔP = ו-Q בכל תדר קצב הטיל סינוסי לזרום לתוך סדרה של הרמוניות סינוסי באמצעות התמרת פורייה. היחס בין הלחץ להפוך לזרום התשואות להפוך את עכבה vascualar ריאתי, PVZ = FFT (ΔP) / FFT (Q), אשר גודל Z ושלב θ. קלט עכבה Z _0, מאפיין עכבה Z _C, מדד גל השתקפות R _W, מחושבים גודל עכבה. בפרט, Z ₀ מחושב Z ב 0 הרמוני (f = 0 הרץ) בממוצע כל התדרים, Z _C מחושב כממוצע של Z בין המינימום הראשון (5 הרץ) ו - 20 הרץ, ו-R _W מחושב כמו (Z-Z _{0 C)} / (Z + Z _{0 C)} ^3.

איור 1 גל תזרים יציב (השורה העליונה) ולחצים שהתקבל. (שורה שנייה: PAP, P _{האוויר,} LAP) כפונקציה של זמן עם שילובים שונים של LAP _ואוויר P. השורה התחתונה מראה PAP לעומת ש ב (א) ו - (ב), מגביר LAP וירידות עם Q כי צינורות יצוא היה במקום. צינור זה הוסר עבור (C) כל כך LAP כי הוא קבוע ועצמאי של ש ב (ד) ו - (ה) את גובה צינורות המוצא הותאם באופן ידני כך LAP גבוה אך עצמאית של ש P _האוויר או ב סוף inspiratory (A, C, D) או סוף הנשיפה (B, E) בלחץ.

איור 2 pulsatile תזרים waveform ש (הפאנל העליון) לחצים הנובעים (פאנל התחתונה: PAP, LAP ו-P _אוויר). כפונקציה של הזמן. מתוך אלה pulsatile לחץ זרימה יחסים ריאתי, PVZ ניתן לחשב, המשקף את סך afterload חדרית הנכון.

צעדים קריטי הניתוח

זה קריטי, כי הטיפול נלקח כאשר חותך את הצלעות מן הריאות. הריאות חייב להיות חשוף באופן מלא מעצורים על ידי הרקמות הסובבות במהלך האינפלציה, אך לא נפגע במהלך תהליך של בידוד. השימוש של אובייקט שטוח כמו בקצה האחורי של מלקחיים ניתן להשתמש כדי להחזיק את הריאות מן הקיר החזה, כך שיש נתיב ברור מספריים לגזור. עוד צעד קריטי הוא המיקום של תפר סביב עורק הריאה לבין אבי העורקים. בעזרת פינצטה ישר הקהה תפחית את הסיכון של ניקוב העורק הריאתי. השלב הקריטי האחרון במהלך הניתוח הוא המיקום של cannulas. אם cannulas גבוהים מדי מעל למישור של כלי גדול כפי שהם היציאה לב, cannulas יכול למשוך את העורק הריאתי או ורידים או ריאתי. אם קנית ב אטריום שמאל נמוך מדי, זה יכול לחסום לזרום לתוך הריאה השמאלית. כתוצאה מכך, תזרים יותר הולך לריאה הימנית, הגדלת PAP ומקרב את התפתחות בצקת ריאות הנכון.

שלבים קריטיים במהלך איסוף הנתונים

איסוף נתונים תזרים יציב צריך להתבצע במהירות, במיוחד עבור ספיקה גבוהה, כך החשיפה של כלי הדם אל הריאות מדגיש גזירה גבוהה נוזל ממוזער. מניסיוננו, גזירה גבוהה מדגיש לגרום לבצקת ריאות. כמו כן, מגביר את הלחץ המהירה גזירה יכולה לגרום לבצקת ריאות. התנאים לקבלת זרימה קבועה, גידול בתזרים של 6 מ"ל / דקה / דקה אינה גורמת לבצקת. שיעורי זרימה קבועה מעל 5 מ"ל / דקה ניתן להשיג ללא בצקת בתנאים מסוימים. יש לנו perfused הריאות שליטה עכברים hypoxic כרוני עם שיעורי זרימה קבועה גבוה ככל 10 מ"ל / דקה בהצלחה.

תדירות מגבלות

התדירות הגבוהה ביותר נבדק על ידינו הוא בדרך כלל 20 הרץ כי אנחנו משתמשים זרימה waveform ש = 3 + 2 חטא (2 ו πt) mL / min. המשאבה המתואר כאן יכול ליצור תנודות בתדרים גבוהים יותר (לפחות 50 הרץ), אולם trade-off הוא ירד אורך שבץ, כלומר, שינוי צורת הגל ש זרימה פיזיולוגיות יותר שבה את גודל תנודה זרימה יורדת עם הגדלת תדר עלולות להיות מדומה עם מערכת זו. לחלופין, משאבה זלוף מותאם אישית יכול לשמש עם בידוד הניתוח אותו ונהלים אוורור המתואר כאן. טווח תדר של מתמרים ללחץ (P75, הרווארד Apparatus, Holliston, MA) הוא כפי שדווח 000-100 הרץ. תגובת תדר בפועל של מתמרים תלויה קשיחות וגודל צינור המשמש לחיבור מתמרים לרשות הפלסטינית LA cannulas. שימוש בצינור מתכת במקום צינורות פוליאתילן יגדילו את התגובה של המערכת. עם זאת, לא ניתן להשתמש בצינור קשיח לחלוטין כי גמישות במיקום צינורית והמיקום יש צורך במהלך הניתוח. עם זאת, תגובת תדר גבוה מתמרים ו / או צינורות קשיחים יותר תגדיל את אות לרעש של מדידות לחץ ולאפשר PVZ שיופק בתדרים גבוהים יותר.

יישומים

הכנה זו ריאות מבודד נעשה שימוש כדי לחקור את ההשפעה של ⁴ תסחיף ריאתי, כמו גם ⁵ היפוקסיה כרונית על pulsatile לחץ זרימה יחסים ריאתי. הוא גם שימש כדי לחקור את ההשפעות של סוכני vasoactive במחזור הדם הריאתי ⁶ ו לכמת את ההשפעות הפרוקסימלית ומ דיסטלי כלי דם ריאתי חמור של עיכוב קינאז Rho ^7. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לכמת את הפיזיולוגיה של כלי הדם הריאתי זנים טהורים או outbred של עכברים בעכברים מהונדסים גנטית או ^8. הפרשנות של הלחץ זרימת נתונים המתקבלים עם הכנה זו ריאות מבודד לא מסובך ידי הבדלים בקצב הלב או תפוקת הלב בין זנים של עכברים. חשוב לציין כי ספקטרום עכבה שהתקבלו מבודד, מאוורר ריאות perfused בתגובה waveform הלא פיזיולוגי לא צריכה להיות בהשוואה ישירות לאלה שהושגו לקראת vivo בתגובה היכו לב נורמלי. כמו כן, in vivo, אוורור היא על ידי לחץ שלילי, לא חיובי את הצמיגות של הדם הוא כ 4-לקפל את הצמיגות של RPMI עם Ficoll.

משמעות

שימוש מבודד, מאוורר, הכנה perfused ריאות העכבר, הצלחנו להראות כי תא שריר חלק דה הפעלה על ידי עיכוב Rho-kinase חריפה אין השפעה ישירה על עמידה של, העורקים הגדולים תעלה באופן משמעותי RV השפעה afterload ^7. החשיבות הקלינית של ציות עורק הפרוקסימלי הוכר ויותר ^9-11. בנוסף, ירד עורק ריאתי ציות הוכח להיות מנבא מצוין של התמותה יתר לחץ דם עורקי ריאתי ^10,11. הגורם העיקרי death מ יתר לחץ דם ריאתי הוא כישלון חדרית הנכונה; גדל אולם עורק ריאתי מתכוון הלחץ לבדו אינו מספיק כדי לגרום לכשל ^12. מדד יעיל יותר של afterload הכולל חדרי הנכון PVZ, אשר תלויה הן הפרוקסימלי ציות והתנגדות דיסטלי ו מחושב pulsatile לחץ ריאתי זרימה יחסים כגון ניתן להשיג בריאות עכבר עם פרוטוקול זה.