Caracterización de los aislados y ventilados, y pulmón de ratón instrumentado perfundidos con flujo pulsátil

En este protocolo se demuestra un hecho aislado y ventilado, la preparación de perfusión del pulmón de ratón que ha sido previamente utilizado para cuantificar el impacto de la embolia pulmonar y la hipoxia crónica sobre pulsátil vascular pulmonar de presión-flujo relaciones (Tuchscherer, Webster, y Chesler, 2006; Tuchscherer et al ., 2007). En resumen, los pulmones del ratón quirúrgicamente aislado de los tejidos circundantes, en una cámara climatizada (IL-1, Harvard Apparatus, Holliston, MA) y ventilado (módulo de control ventilatorio (VCM)-R con temporizador módulo contador (TCM), la Universidad de Harvard aparatos). La vasculatura pulmonar es perfundido con calefacción RPMI 1640 medio de cultivo celular con el 3,5% Ficoll utilizando una bomba de jeringa (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) para generar las formas de onda de flujo estacionario o una bomba de alta frecuencia oscilatoria (Bose-Electro Fuerza, Eden Prairie, MN) en paralelo con la bomba de jeringa para crear formas de onda pulsátil del flujo vascular pulmonar. Transductores de presión (P75, Harvard Apparatus) medir la presión instantánea arteria pulmonar (PAP) y la presión de la aurícula izquierda (LAP). El caudal instantáneo (Q) se mide con un medidor de flujo en línea (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY). Pulsátil de presión-flujo relaciones se derivan de estas mediciones, que dar una idea de la fisiología pulmonar vascular y la patología y la poscarga del ventrículo derecho.

1. Equipos:

1. Pulmonar aislada, set-up incluyendo ventilador del ratón
2. Sistema de adquisición de datos y el ordenador con el programa LabView
3. Dos transductores de presión y caudal de flujo de perfusión
4. Transductor de presión y caudal (pnemotachometer) para el flujo de las vías respiratorias
5. De alta frecuencia oscilatoria de la bomba y el ordenador con el programa de prueba de Windows
6. Boom / zoom del microscopio, la lámpara
7. Calefacción baño con bomba de alto rendimiento para IL-1

2. Preparación de la IL-1

1. El agua destilada calentada a 37 ° C por el baño de calentamiento se distribuye en el interior de la IL-1.
2. Todas las bombas, los transductores y la cánula de la IL-1 se conecta a través de la tubería limpia y todos los tubos se lava con agua destilada calentada a 37 ° C. Las burbujas de aire, que podría viajar a los pulmones y causan edema, debe ser eliminado. Tubo de la bomba de flujo oscilatorio en el sensor de flujo y del sensor de flujo a la cánula arterial pulmonar se lavan con PBS 1%.
3. El P75 transductores de presión se ponen a cero mediante el cierre de la válvula a la cánula, la apertura de las válvulas a la atmósfera y luego pulsar el botón automático de cero en el amplificador PLUGSYS. Entonces, la válvula a la atmósfera se cierra y se abre la válvula a la cánula.
4. La pieza de cerámica porosa en la vía de ventilación de la IL-1 se humedece para proporcionar la humedad.

3. Soluciones

1. Prepare un 3,5% en volumen de Ficoll-RPMI solución de filtro estéril y los medios de comunicación. Filtrado de los medios de comunicación asegura que no hay partículas grandes que sin querer podría embolizar el pulmón. El uso de material estéril, también reduce la probabilidad de edema repentino en desarrollo en el pulmón. Llene una jeringa de 10 ml con RPMI para la cirugía y una jeringa de 60 ml con RPMI para cada ensayo experimental. Calentar la perfusión en un baño de agua a 37 ° C.
2. Prepare 1 ml de heparina de peso corporal 500IU/100g del ratón (aproximado). La sal de la heparina se 158IU/mg. Para un ratón ~ 25 g, mezcla de 1,25 mg de sal de heparina con 1 ml solución de PBS en un tubo de microcentrífuga pequeños.

4. Ventilación de un ratón

1. Después de una inyección intraperitoneal de pentobarbital 150 mg en solución por kilogramo en el ratón, asegúrese de anestesia profunda mediante la realización de una pizca duro en una pata. Si no hay reacción, preparar el ratón para la cirugía por poniendo sus patas delanteras para panel de corcho para la estabilidad. Nota: A lo largo de la profundidad anestésica experimento se controla mediante una cuidadosa observación de los animales. Los pasadores en las patas y las incisiones con frecuencia actúan como estímulos nocivos, la falta de respuesta a lo que confirma que el animal permanece en un plano quirúrgico de anestesia.
2. Rocíe el pecho con un 95% de alcohol para humedecer la piel y el uso de fórceps directamente a agarrar la piel en el cuello. Un corte de 1 cm de abertura en la piel con las tijeras rectas.
3. Una vez que la parte interior del cuello está expuesto, eliminar todo el tejido glandular blanco y el músculo superficial, buscando el esófago y la tráquea. Aislar el esófago y la tráquea de los tejidos de ambos lados y hacia atrás.
4. Inserte la pinza pequeña inclinación en la tráquea y agarrar un pedazo de sutura en el otro lado. Tire de la sutura en la tráquea y corbata suelta el nudo cirujanos. No apriete la sutura o atar el nudo.
5. Corte un pequeño ángulo en "V" en la tráquea con unas tijeras pequeñas, no corte todo el camino a través de la tráquea. Mover el tablero de corcho y el ratón a la IL-1 se calienta el sistema. Usando las dos pinzas romas, toma de la cánula traqueal y la tráquea por debajo de la "v". A continuación, deslice la cánula traqueal en la tráqueaea través de la "v" de apertura. Apriete la sutura alrededor de la tráquea y la cánula traqueal para asegurar la cánula en el interior de la tráquea. Atar el nudo.
6. Comenzar la ventilación (50% inspiración, 90 respiraciones / min, con la inspiración profunda) con el aire ambiente.

5. Perfusión de un ratón con ventilación

5.1. El acceso al ventrículo derecho para inyectar heparina

1. Aspersión del ratón en el pecho con alcohol de nuevo para volver a humedecer la piel. Eliminar toda la piel en el pecho por encima de las costillas con las pinzas y tijeras rectas recta. Corte hacia arriba a lo largo del esternón. Levante la piel en cada lado y luego se corta la piel después de la línea de las costillas inferiores.
2. Comprender el proceso xifoides en la parte inferior del esternón con unas pinzas y un agujero en el diafragma con las tijeras rectas. Coge la membrana con las pinzas y cortar lejos de las costillas.
3. Comprender el proceso xifoides de nuevo con las pinzas (mano izquierda) y el uso de la punta de bola, ángulo tijeras para cortar el esternón y las costillas, teniendo cuidado de no cortar los pulmones, el corazón o los vasos sanguíneos (el uso del balón en la punta las tijeras que le guiará). Habrá sangre, pero siempre y cuando el filo de las tijeras es contra el esternón, el corazón y los pulmones no se corte.
4. Tome las costillas en el lado izquierdo y cortar la mayor cantidad de las costillas cuando sea necesario para exponer el corazón. Inyecte lentamente el ventrículo derecho con la solución 0,1 ml de heparina. Este paso es importante para prevenir los coágulos sanguíneos en el pulmón, que dañan las células endoteliales y poner en peligro la perfusión. La heparina debe ser inyectada, mientras el corazón sigue latiendo.

5.2. Canular la arteria pulmonar

1. Cortar el resto de las costillas (lado izquierdo y derecho) utilizando la parte de atrás (redondeado) extremo de la pinza para empujar suavemente los pulmones de la pared torácica. Acaparamiento de los pulmones se puede dañar el delicado tejido. Contacto accidental entre las puntas de las tijeras y el tejido pulmonar también puede causar daños.
2. Mover el microscopio en su lugar sobre los pulmones. Cortar el tejido glandular y graso en la parte superior del corazón. Utilice las pinzas para tirar de las arterias y las venas y luego se corta con las tijeras de primavera, mientras que el tejido está en tensión.
3. Utilizando otro conjunto contundente de pinzas, pala de derecha a izquierda desde la parte superior del corazón en la aurícula izquierda / ventrículo para conseguir la punta de la pinza en la aorta y la arteria pulmonar (AP). Haga esto con cuidado, no debe haber resistencia a las pinzas. Utilizando unas pinzas romas reduce la probabilidad de accidente punción de la arteria pulmonar o la aorta.
4. Una vez que la punta de la pinza es en la aorta y la Autoridad Palestina, agarra un pedazo de sutura y salir adelante. Haga un nudo suelto cirujanos. No apriete la sutura o atar el nudo.
5. Opcional: utilizar las tijeras en ángulo para eliminar la mitad inferior del cuerpo. Cortar a lo largo de las costillas y la columna vertebral, el corte de la aorta y la vena cava causará una gran cantidad de sangre fluya - usar un Q-tip para detener el flujo. Coloque en una bolsa para su eliminación.
6. Primer PA cánula con 4 ml de una jeringa de 10 ml de RPMI. Compruebe que toda la tubería está libre de burbujas de aire. Perfusión del pulmón con agua destilada o burbujas se traducirá en edema.
7. Corte una muesca pequeña en la pared libre del ventrículo derecho e inserte la cánula PA, con el objetivo hacia abajo y hacia la derecha. La punta de la cánula debe ser visible a través de la pared transparente de la Autoridad Palestina. Infundir una pequeña cantidad de RPMI para confirmar el lugar. Apriete la sutura alrededor de la cánula, la aorta y la Autoridad Palestina y atar el nudo. Tenga en cuenta que en este punto, la aorta también se ligan para perfusión real no debe comenzar hasta la aurícula izquierda se canula.

5.3. Canular la aurícula izquierda

1. Corte una muesca en la parte inferior del ventrículo izquierdo y la aurícula izquierda inerte cánula (LA), con el objetivo hacia arriba. Una ligera presión puede ser necesaria para abrir la válvula mitral en esta dirección. En la ubicación correcta, la punta de la cánula se desliza a través y ser seguro sin sutura.

5.4. Comenzar la perfusión

1. Manualmente infundir RPMI de la jeringa de 10 ml a 0,3 ml por minuto hasta que RMPI es evidente en la tubería de salida (de color rosa-ish color en contraste con la clara PBS). Si no hay flujo en la tubería de salida, vuelva a la posición de la cánula de Los Ángeles. Si no hay flujo de salida se puede obtener con el cambio de posición, compruebe si hay una fuga en la arteria pulmonar. Una fuga o un desgarro de la arteria pulmonar no se pueden reparar, lo que es motivo de abortar el experimento.
2. Conecte una jeringa de 60 ml a la cánula PA a través de la IL-1 e iniciar la infusión 1ml/min de perfusión, el control de fugas y asegurarse de que los pulmones se ponen blancos, lo que demuestra que RPMI es reemplazar la sangre en los pulmones. Perfundir con flujo lento durante dos minutos.

6. Medición pulsátil y constante del flujo pulmonar de presión Relaciones

1. Para los estudios de flujo pulsátil, en primer lugar establecer el desplazamiento de la bomba de pistón oscilante enlos niveles deseados para cada frecuencia de la Wintest programa basado en experimentos anteriores. Variabilidad debida a la estructura pulmonar y la mecánica, los desplazamientos tienen que ser ajustados para cada ratón. Definir el flujo constante al nivel deseado. Abra la válvula a la bomba oscilatoria y empezar a registrar los datos antes de ejecutar el derecho de perfil de flujo oscilatorio (programa Wintest). Abra el archivo de datos y trazar el flujo experimental (Q) en Excel. Ajuste el desplazamiento de la bomba de pistón oscilante en cada frecuencia (programa Wintest) de modo que Q max y min Q son como se desee.
2. Para los ensayos de flujo constante, cierre la válvula a la bomba de oscilación. Si esta válvula se queda abierta, la bomba oscilante actúa como un condensador, amortiguando los cambios de velocidad de flujo a otro. Recoger datos durante al menos 10 segundos en cada velocidad de flujo o hasta que la presión de la AP no varía en más del 5%.
3. Para las mediciones de flujo pulsátil o sea estable, la ventilación de edad a una presión constante antes de la recolección de datos. Reanudar la ventilación inmediatamente después de la recolección de datos.
4. Esté atento a RPMI en el tubo de las vías respiratorias, lo cual es evidencia de edema y es motivo de abortar el experimento. También, no deje que RPMI alcanzar la presión de las vías respiratorias o el flujo de los sensores, ya que puede dañar los transductores.

7. Los resultados representativos:

Representante de resultados estables:

En el pulmón aislado configurar el experimentador tiene la capacidad de controlar de forma independiente, no sólo el flujo pulmonar Q, sino también las vías respiratorias LAP presión P _{de aire} y presión de la aurícula izquierda. Esto es ventajoso porque Q, P y LAP _aire influyen en la vasculatura pulmonar y la consiguiente presión de la arteria pulmonar PAP. Otra ventaja es que los resultados obtenidos son independientes del tono del sistema nervioso simpático ^1, el estado del volumen, y la anestesia ^2.

PAP cambios inducidos por los cambios de escalera-in-Q para el _aire fijo P y ya sea fijo o variable LAP se muestra en la Figura 1. Tenga en cuenta que en la preparación de pulmón aislado, la cánula LAP suele estar conectado a un tubo que dirige la perfusión en un contenedor de residuos. Con este tubo en su lugar, LAP es linealmente dependiente, debido al flujo de Poiseuille Q. Sin embargo, la altura de la salida del contenedor de residuos y se puede ajustar manualmente para proporcionar una constante, no cero LAP o el tubo puede ser removido para permitir cero LAP que es independiente de Q.

Representante Resultados pulsátil:

Mientras que las formas de onda arbitraria flujo pulsátil se pueden generar con este sistema, que suelen generar flujo de la forma Q = 3 + 2 sen (2 f πt) ml / min en las frecuencias de f = 1, 2, 5, 10, 15 y 20 Hz para evaluar la impedancia lineal de la vasculatura pulmonar (Figura 2: panel superior). A partir de las mediciones resultantes PAP, LAP y Q, la magnitud de impedancia pulmonar vascular (Z) y la fase (θ) se calculan en primer lugar, la descomposición de un ciclo completo sinusoidal de DP = PAP-LAP y Q en cada impuesto frecuencia sinusoidal caudal en una serie de armónicos sinusoidales con una transformada de Fourier. La relación entre la presión de transformar el flujo de los rendimientos de transformar la impedancia pulmonar vascualar, PVZ = FFT (DP) / FFT (Q), que tiene una magnitud Z y la fase θ. Impedancia de entrada Z _0, impedancia característica Z _C, y el índice de reflexión de la onda _W R, se calcula a partir de la magnitud de la impedancia. En particular, Z ₀ Z se calcula a partir de la 0 ª armónica (f = 0 Hz) entre todas las frecuencias, Z _C se calcula como el promedio de Z entre el primer mínimo (5 Hz) y 20 Hz, y R _W se calcula como (Z _{0-Z C)} / (Z ₀ + Z _C) ^3.

Figura 1 Flujo constante de onda (fila superior) y las presiones resultantes. (Segunda fila: PAP, P _aire, LAP) en función del tiempo con diferentes combinaciones de LAP y el _aire P. La fila inferior muestra PAP vs P. En (A) y (B), aumenta y disminuye con la LAP Q debido a que el tubo de salida estaba en su lugar. Este tubo fue removido de (C) para que LAP es constante e independiente de P. En (D) y (E) de la altura de la tubería de salida se ajusta manualmente para que LAP es mayor, pero independiente de P. P _aire, ya sea en final de la inspiración (A, C, D) o final de la espiración (B, E) de presión.

Figura 2 flujo pulsátil de onda Q (panel superior) y las presiones resultantes (panel inferior: PAP, LAP y el _aire P). En función del tiempo. A partir de estos pulsos de presión-flujo pulmonar relaciones, PVZ se puede calcular, lo que refleja el total de la poscarga del ventrículo derecho.

Pasos críticos en la operación

Es muy importante que se tenga cuidado al cortar la caja torácica de los pulmones. Los pulmones deben estar totalmente expuesto y sin inhibiciones por los tejidos circundantes durante la inflación, pero no dañado durante el proceso de aislamiento. El uso de un objeto plano, como la parte de atrás de la pinza puede ser usado para mantener los pulmones de la pared del pecho para que no haya un camino claro para las tijeras para cortar. Otro paso fundamental es la colocación de la sutura alrededor de la arteria pulmonar y la aorta. Uso de unas pinzas rectas embotado reducirá el riesgo de perforar la arteria pulmonar. El último paso crítico durante la cirugía es la colocación de las cánulas. Si las cánulas son muy altos por encima del plano de los grandes vasos que salen del corazón, las cánulas pueden tirar en la arteria pulmonar o venas pulmonares. Si la cánula en la aurícula izquierda es demasiado bajo, puede bloquear el flujo hacia el pulmón izquierdo. Como consecuencia, un mayor flujo se dirige al pulmón derecho, el aumento de la PAP y acelerar el desarrollo de edema en el pulmón derecho.

Los pasos críticos en la recopilación de datos

Flujo constante de recolección de datos debe realizarse con rapidez, sobre todo para grandes caudales, por lo que la exposición de la vasculatura pulmonar a altas tensiones de corte de fluido se reduce al mínimo. En nuestra experiencia, de corte altas tensiones llevar a un edema pulmonar. Asimismo, el aumento rápido de la tensión de corte puede causar edema pulmonar. Bajo condiciones de flujo constante, un aumento del flujo de 6 ml / min / min no causa edema. Las tasas sin cambios el flujo de más de 5 ml / min se puede obtener sin edema en determinadas condiciones. Tenemos perfundidos pulmones de los ratones de control y de hipoxia crónica con tasas de flujo continuo de hasta 10 ml / min con éxito.

Limitaciones de frecuencia

La mayor frecuencia probadas por nosotros es típicamente de 20 Hz, ya que utilizamos un flujo de ondas Q = 3 + 2 sen (2 f πt) ml / min. La bomba se describen aquí pueden generar oscilaciones en frecuencias más altas (por lo menos 50 Hz), sin embargo la compensación se reduce la longitud de carrera, es decir, el cambio en P. Una onda de flujo más fisiológico en el que la magnitud de la oscilación de flujo disminuye con la frecuencia cada vez mayor probablemente podrían ser simulados con este sistema. Por otra parte, una bomba de perfusión medida podría ser utilizado con el mismo aislamiento y procedimientos quirúrgicos de ventilación se describe aquí. El rango de frecuencia de los transductores de presión (P75, Harvard Apparatus, Holliston, MA) es reportado como 000 a 100 Hz. La respuesta de frecuencia real de los transductores depende de la rigidez y el tamaño de la tubería usada para conectar los transductores a la Autoridad Palestina y cánulas de Los Ángeles. Utilizando tubos de metal en vez de tubos de polietileno que aumenta la respuesta del sistema. Sin embargo, no es posible utilizar tubos rígidos completamente porque la flexibilidad en la ubicación y colocación de la cánula se necesitan durante la cirugía. Sin embargo, el aumento de transductores de respuesta de frecuencia y / o más tubos rígidos aumentaría la relación señal-ruido en las mediciones de la presión y permitir PVZ que se obtengan en frecuencias más altas.

Aplicaciones

Esta preparación de pulmón aislado se ha utilizado para investigar el efecto de ^cuatro embolia pulmonar, así como hipoxia crónica en ^cinco pulsos de presión-flujo pulmonar relaciones. También se utilizó para investigar los efectos de agentes vasoactivos en la circulación pulmonar ⁶ y cuantificar el proximal y distal efectos vascular pulmonar aguda rho inhibición de la cinasa ^7. Esta técnica puede ser utilizada para cuantificar la fisiología vascular pulmonar en cepas puras o en reproducción de los ratones y los ratones genéticamente modificados ^8. La interpretación de los datos de presión-flujo obtenidos con esta preparación pulmonar aislada, no es complicado por las diferencias en la frecuencia cardíaca o el gasto cardíaco entre las cepas de ratones. Es importante tener en cuenta que los espectros de impedancia obtenidos en un caso aislado y ventilado pulmón perfundido en respuesta a una forma de onda no fisiológico no debe compararse directamente con los obtenidos en una preparación in vivo en respuesta a un ritmo normal del corazón. Además, en vivo, la ventilación es negativo, no positivo, la presión y la viscosidad de la sangre es de aproximadamente 4 veces la viscosidad de RPMI con Ficoll.

Significado

Utilizando el aislado y ventilado, la preparación de perfusión del pulmón del ratón, hemos sido capaces de demostrar que las células musculares lisas de la activación aguda por inhibición de la Rho-kinasa no tiene ningún efecto directo sobre el cumplimiento de las arterias de conducción general, que significativamente la postcarga RV impacto ^7. La importancia clínica de cumplimiento de la arteria proximal ha sido reconocido cada vez más ^9.11. Además, disminución de la distensibilidad principal arteria pulmonar ha demostrado ser un excelente predictor de la mortalidad en la hipertensión arterial pulmonar ^10,11. La principal causa de death de la hipertensión pulmonar es la insuficiencia ventricular derecha, sin embargo aumento de la presión arterial pulmonar media sí sola no es suficiente para causar una falla ^12. Una medida más eficaz de la poscarga del total de ventrículo derecho es PVZ, que depende tanto de cumplimiento proximal y distal y la resistencia se calcula a partir pulsátil pulmonar de presión-flujo, tales como las relaciones se pueden obtener en los pulmones del ratón con este protocolo.