मानव कोशिकाओं के एक बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा आक्रमण

Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693, doi:10.3791/2693 (2011).

यहाँ हम का वर्णन करेंगे कैसे हम बैक्टीरिया रोगज़नक़ Staphylococcus aureus द्वारा मानव endothelial कोशिकाओं के आक्रमण का अध्ययन . सामान्य प्रोटोकॉल वस्तुतः किसी भी कृषि जीवाणु द्वारा सेल आक्रमण के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है. चरणों पर जो आक्रमण के विशिष्ट पहलुओं का अध्ययन किया जा सकता है actin पुनर्व्यवस्था या caveolae की भूमिका के रूप में, पर प्रकाश डाला जाएगा. होस्ट कोशिकाओं बोतल में बड़े हो रहे हैं और जब इस्तेमाल के लिए तैयार 24-अच्छी तरह से Thermanox coverslips युक्त प्लेटों में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. Coverslips का उपयोग कुओं से कोशिकाओं के बाद हटाने कुओं (जो एस aureus देते हैं) के पक्षों पर जमा सीरम प्रोटीन से हस्तक्षेप को कम करने के लिए अनुमति देता है . जीवाणु आवश्यक घनत्व के लिए बड़े हो रहे हैं और किसी भी secreted प्रोटीन (जैसे जहर) को हटाने के लिए धोया. मिला हुआ परतों के साथ endothelial कोशिकाओं के Coverslips नए 24 अच्छी तरह से बैक्टीरिया के अलावा ताजा संस्कृति के माध्यम से पहले से युक्त प्लेटों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. समय के लिए आवश्यक राशि के लिए जीवाणु और कोशिकाओं तो एक साथ 37 पर _5% सीओ 2 में incubated डिग्री सेल्सियस एस के लिए aureus यह आमतौर पर 15-90 मिनट के बीच है . Thermanox coverslips प्रत्येक अच्छी तरह से हटा रहे हैं और पीबीएस में डुबकी धोया स्वाधीन बैक्टीरिया को दूर है. यदि कुल जुड़े बैक्टीरिया (पक्षपाती और भली भाँति) के लिए मात्रा निर्धारित हो रहे हैं, coverslips तो एक ताजा अच्छी तरह से में रखा जाता है युक्त 0.5% ट्राइटन पीबीएस में X-100. कोमल pipetting सेल lysis को पूरा करने और बैक्टीरिया धारावाहिक कमजोर पड़ने और चढ़ाना द्वारा अगर पर enumerated हैं होता है. अगर जीवाणुओं की संख्या है कि कोशिकाओं पर आक्रमण किया है की जरूरत है, coverslips कुओं 500 μl ऊतक संस्कृति gentamicin और ऊष्मायन साथ पूरक मध्यम युक्त 1 ज के लिए जारी रखा, जो सभी बाहरी जीवाणुओं को मारने के लिए जोड़ रहे हैं. Coverslips फिर धोया जा सकता है, कोशिकाओं के lysed और बैक्टीरिया अगर पर चढ़ाना द्वारा प्रगणित के रूप में ऊपर वर्णित है. यदि प्रयोग प्रत्यक्ष दृश्य की आवश्यकता है, coverslips और तय किया जा सकता है दाग प्रकाश, प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी के लिए या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार है.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल एस द्वारा endothelial सेल आक्रमण के अध्ययन का वर्णन करेंगे aureus लेकिन सैद्धांतिक किसी भी कृषि जीवाणु द्वारा सेलुलर आक्रमण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एस करने के लिए विशिष्ट चरणों aureus और endothelial कोशिकाओं का संकेत कर रहे हैं.

1. जीवाणुओं की तैयारी

1. संस्कृति एस. 4-16 (विकास आवश्यक चरण पर निर्भर करता है) 10 मिलीलीटर आसव ब्रेन - हार्ट शोरबा (भी) में 37 ° घंटे 200 rpm पर झटकों के साथ हवा में सी के लिए aureus उपभेदों. ये विकास की स्थिति एस के लिए विशिष्ट हैं aureus और अन्य जीवाणुओं के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है .
2. कमरा (पाँच हज़ार x जी, 10 मिनट) तापमान, संस्कृति और बैक्टीरियल गोली की सतह पर तैरनेवाला resuspension DMEM के एक बराबर मात्रा में हटाने पर centrifugation के वैकल्पिक दौर से, बैक्टीरिया Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (Invitrogen DMEM) में तीन बार धो लें. बैक्टीरिया है जो तब के रूप में आवश्यक समायोजित किया जा सकता है के परिणामस्वरूप निलंबन के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के. एस के लिए aureus, हम ₆₀₀ आयुध डिपो = 1 है, जो ~ ¹⁰ 9 cfu ^{मिलीलीटर} -1 से मेल खाती है पर एक निलंबन तैयार .

2. Endothelial सेल संस्कृति

1. 37 पर और एल glutamine (2 मिमी) डिग्री सेल्सियस 5% सीओ ₂ में, संस्कृति DMEM में endothelial सेल लाइन ¹ EA.hy926 भ्रूण गोजातीय (10% FBS) सीरम के साथ पूरक . वैकल्पिक रूप से, जमा प्राथमिक मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) Lonza (बेसल, स्विट्जरलैंड) से खरीदा जा सकता है और endothelial बेसल 37 पर 2% FBS, गोजातीय मस्तिष्क निकालने (हेपरिन सहित), मानव endothelial वृद्धि कारक और hydrocortisone के साथ पूरक मध्यम में सभ्य डिग्री सेल्सियस में 5% सीओ ₂ के निर्माता के निर्देशों (Lonza) के अनुसार . ये विकास की स्थिति इन कोशिकाओं के लिए विशिष्ट हैं और अन्य मेजबान कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता हो सकती है.
2. T75 बोतल में endothelial कोशिकाओं को विकसित confluency पूरा, आँख द्वारा सत्यापित.
3. Coverslips के सम्मिलन के लिए 24 अच्छी तरह प्लेटें तैयार. ठीक संदंश (निष्फल लौ) coverslips, जो एक अपारदर्शी और एक चमकदार सतह है स्थानांतरित करने के लिए की जरूरत है. अपारदर्शी ऊपर की ओर का सामना करना पड़ सेल लगाव की अनुमति सतह के साथ 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में रखें coverslips.
4. आजाद 3 मिलीलीटर trypsin EDTA (0.25%) के साथ T75 कुप्पी से कोशिकाओं और प्रासंगिक संस्कृति के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
5. 24 अच्छी तरह प्लेटें Thermanox कांच coverslips युक्त resuspended कोशिकाओं के 500 μl जोड़ें. कक्षों की एक T75 मिला हुआ फ्लास्क दो 24 अच्छी तरह प्लेटों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं प्रदान की है, लगभग 5 में जिसके ^{परिणामस्वरूप} × अच्छी तरह से 5 प्रति 10 कोशिकाओं (500 μl मध्यम में).
6. 48 घंटे के लिए प्लेटें सेते ऊपर वर्णित के रूप में, और 100% औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा confluency सेल सत्यापित.
7. डुबकी धोने पीबीएस में coverslips और नए 24 अच्छी तरह प्लेटें युक्त 490 μl प्रत्येक अच्छी तरह से 10% FBS युक्त DMEM को जोड़ने.
8. सेल आक्रमण में विशिष्ट चयापचय प्रक्रियाओं की भूमिका की जांच करने के लिए, inhibitors घंटे पहले सुसंस्कृत बैक्टीरिया और सांद्रता परख के दौरान बनाए रखा के अलावा 1 कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है है. उदाहरण के लिए, एस में actin पुनर्व्यवस्था की भूमिका निर्धारित करने के लिए endothelial कोशिकाओं के आक्रमण aureus, 50 सुक्ष्ममापी cytochalasin डी जोड़ा जा सकता है, या caveolae, 5 की भूमिका के लिए मिथाइल β-cyclodextrin मिमी जोड़ा जा सकता है .

3. आक्रमण परख

1. प्रत्येक endothelial कोशिकाओं की 490 μl DMEM में मिला हुआ परत 10% FBS युक्त के साथ अच्छी तरह धोया coverslip युक्त धोया जीवाणुओं की 10 μl (लगभग × ² 10 7 ^cfu मिलीलीटर -1 एस aureus में जिसके परिणामस्वरूप ) जोड़ें.
2. 37 पर 15-90 मिनट के लिए सेते ° _5% सीओ 2 में सी .
3. कोशिकाओं (पक्षपाती और भली भाँति) के साथ जुड़े बैक्टीरिया की कुल संख्या को मापने के लिए, coverslips पीबीएस में तीन बार डुबकी धोने और ताजा पीबीएस में 500 μl 0.5% Triton एक्स 100 कुओं को जोड़ने. यह सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को पूरी तरह lyse और सभी भली भाँति बैक्टीरिया जारी, कई बार पिपेट, coverslip की सतह पर सीधे पिपेट की नोक की ओर इशारा करते हुए.
4. TSA प्लेटों की सतह पर तरल निलंबन (या यह आवश्यक जहां dilutions) चढ़ाना द्वारा बैक्टीरिया की गणना करें. 100-TX के बाद से कई ग्राम नकारात्मक जीवाणुओं ^lyse, सैपोनिन 2 बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. भली भाँति जीवाणुओं की संख्या को मापने के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त अनबाउंड बैक्टीरिया से संस्कृति सतह पर तैरनेवाला निकालने और 500 μl DMEM/10% μg ²⁰⁰ मिलीलीटर -1 gentamicin साथ पूरक FBS के साथ प्रतिस्थापित. हम नियमित gentamicin बल्कि lysostaphin की तुलना में यहाँ का उपयोग के रूप में यह सस्ता है और हमें बैक्टीरिया के विभिन्न प्रकारों (जैसे staphylococci और Lactococci) का उपयोग कर प्रयोगों के बीच प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को बदलने के बिना स्विच करने के लिए अनुमति देता है.
6. 37 में प्लेटें सेते ° सी 60 से सभी कोशिकी बैक्टीरिया को मारने मिनट के लिए _5% सीओ 2 में .
7. Coverslips पीबीएस में 3 बार धो,lyse और TSA पर चढ़ाना द्वारा एन्यूमरेट रूप आसंजन परख के लिए ऊपर वर्णित.
8. कुछ मामलों में यह बेहतर हो सकता है नेत्रहीन प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर जीवाणुओं की संख्या गिनती हो सकती है. इस उदाहरण में, और विशिष्ट एस. aureus सेल आक्रमण, gentamicin के बजाय lysostaphin (10 μg ^-1 मिलीलीटर) का उपयोग करने के लिए शारीरिक कोशिकी जीवाणुओं को नष्ट.
9. 37 में 20min के लिए coverslips सेते ° सी सीओ ₂ में lysostaphin समाधान में, तो कुल्ला और Cytopath (Cellpath) के साथ ठीक है.
10. 5min के लिए क्रिस्टल बैंगनी (0.5%, w / v) के साथ coverslips बाढ़.
11. पानी, हवा शुष्क में डुबकी कुल्ला और गिलास स्लाइड पर माउंट. मिला हुआ endothelial कोशिकाओं के ² मिमी प्रति जीवाणुओं की संख्या प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

एस की सतह पर fibronectin बाध्यकारी प्रोटीन की अभिव्यक्ति (FnBPA और FnBPB) aureus endothelial कोशिकाओं पर आक्रमण करने की क्षमता प्रदान. हाल ही में काम fibronectin बाध्यकारी FnBPA ³ के डोमेन नए सिरे से परिभाषित है. जंगली प्रकार के एस (WT) उच्च दक्षता के साथ 8325.4 aureus endothelial कोशिकाओं पर हमला, whilst दोनों FnBPA और बी (Δ एफएनबी) की कमी तनाव internalisation की काफी कम स्तर (चित्रा 1 ए) से पता चला है. एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग एफएनबी के साथ उत्परिवर्ती के complementation एक ऋण fibronectin बाध्यकारी डोमेन (pFnR0) आक्रमण (चित्रा 1 ए) का प्रचार नहीं किया. इसके विपरीत करके, एक प्लाज्मिड पूरी एफएनबी एन्कोडिंग एक (pFnBA4) जीन WT स्तर (चित्रा 1A) के आक्रमण बहाल के साथ उत्परिवर्ती complementation .

endothelial सेल आक्रमण में FnBPA की भूमिका भी heterologous अभिव्यक्ति मेजबान Lactococcus lactis का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है . एल में प्लाज्मिड इनकोडिंग FnBPA की अभिव्यक्ति lactis ⁽⁹ pRM9) काफी बैक्टीरिया व्यक्त नहीं (सीटीएल) FnBPA (खुला सलाखों, चित्रा 1 बी) के लिए तुलना में endothelial कोशिकाओं के आसंजन में वृद्धि नहीं था. इसके विपरीत करके, एल FnBPA व्यक्त lactis गैर व्यक्त तनाव (बंद सलाखों, चित्रा 1 बी) की तुलना में काफी उच्च स्तर पर endothelial कोशिकाओं पर आक्रमण किया.

प्रयोगों से दो प्रतियों में चार बार और मतलब ± मानक विचलन प्रस्तुत किया जाता है प्रदर्शन किया गया. * डेटा है कि सांख्यिकीय महत्वपूर्ण WT या सीटीएल मूल्यों (= 0.05 <पी) से अलग कर रहे हैं का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 1 EA के आक्रमण. एस द्वारा Hy926 endothelial कोशिकाओं aureus (एक) या एल lactis (बी).

परख का वर्णन हम gentamicin संरक्षण परख, जो व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है जीवाणुओं द्वारा मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण का अध्ययन पर आधारित है. Gentamicin और अन्य intracellular जीवाणुओं को मारने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की अक्षमता की टिप्पणियों प्रारंभिक अध्ययन ^में बैक्टीरिया 4-8 से मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण पर उपयोग किया गया. 24, 48 या भी 96 अच्छी तरह प्लेटें का उपयोग मात्रात्मक और अपेक्षाकृत कम लागत पर समय की एक छोटी अवधि में, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा की बड़ी मात्रा में के उत्पादन की अनुमति देता है. परख भी आकर्षक है क्योंकि यह कोई विशेषज्ञ के उपकरणों की आवश्यकता है यह विभिन्न जीवाणुओं और कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए सिलवाया किया ^जा सकता है है, और 9 आक्रमण में दोनों बैक्टीरिया और मेजबान सेल प्रक्रियाओं की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, जल्द से जल्द प्रयोगों के बाद, gentamicin संरक्षण परख व्यापक रूप से किया गया है अलग बैक्टीरिया या ^10,11 बैक्टीरिया का भी संयोजन की एक श्रृंखला के द्वारा मेजबान सेल आक्रमण को मापने के लिए कार्यरत है. मूल सिद्धांतों के रूप में एक ही विधि में कई सूक्ष्म रूपांतरों रहे हैं की सूचना दी गई है. इस अनुच्छेद में हम अपने संस्करण का वर्णन किया है और संकेत दिया जहां संशोधनों अन्य बैक्टीरिया या मेजबान कोशिकाओं के लिए आवश्यक हो सकता है. जब एक मेजबान सेल महत्वपूर्ण बिंदुओं के एक नंबर पर विचार कर रहे हैं इस दृष्टिकोण का उपयोग आक्रमण को मापने के लिए प्रयोग डिजाइन

Gentamicin के लिए बैक्टीरियल संवेदनशीलता. यह स्पष्ट है, लग सकता है लेकिन यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि अध्ययन किया जा रहा जीवाणु एकाग्रता, तापमान, और समय की अवधि से अधिक के लिए इस्तेमाल किया जा gentamicin के लिए अतिसंवेदनशील है . असंवेदनशीलता के मामले में, यह अन्य एंटीबायोटिक दवाओं ⁵ का उपयोग संभव हो सकता है. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण lytic (lysostaphin, mutanolysin, lysozyme) एंजाइमों ¹² का उपयोग किया जा सकता है .

ऊष्मायन और inoculum जब पहली बार के लिए इस परख प्रदर्शन यह इष्टतम ऊष्मायन बार और बैक्टीरिया के लिए इस्तेमाल किया जा inoculum स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, प्रारंभिक प्रयोगों दोनों आसंजन और समय पर आक्रमण (6 घंटे के लिए 5 मिनट) जांच करनी चाहिए. यह भी महत्वपूर्ण है आकलन कैसे आक्रमण संक्रमण की बहुलता से प्रभावित है (MOI, सेल प्रति जीवाणुओं की संख्या). सामान्य में यह सबसे अच्छा संभव जीवाणुओं की fewest संख्या के उपयोग के रूप में इस संवर्धित कोशिकाओं को नुकसान कम हो जाएगा. उपभेदों के बीच महत्वपूर्ण मतभेद अगर विस्तारित ऊष्मायन अवधि या बड़े inocula ^9,13 इस्तेमाल कर रहे हैं याद किया जा सकता है.

सेलुलर क्षति यह बैक्टीरिया से पहले धो उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, सेलुलर क्षति विष उत्पादन के लिए सीमित नहीं है. जीवाणु आक्रमण, apoptosis और सामान्य सेलुलर कार्यों के विघटन के अधिष्ठापन सभी सेलुलर क्षति पैदा कर सकता है. यह gentamicin सेल में प्रवेश के लिए सीसा, भली भाँति जीवाणुओं को मारने और धारणा है कि ^{आक्रमण} 14 नहीं हुआ है दे सकते हैं.

ऊष्मायन शर्तों तापमान की संरचना और संस्कृति के माध्यम आक्रमण पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. उदाहरण के लिए, HELA कोशिकाओं के Streptococcus pyogenes द्वारा आक्रमण घुलनशील fibronectin, जो आम तौर पर ¹⁵ सीरम में मौजूद है की उपस्थिति पर निर्भर है . एक और विचार के प्रयोग के दौरान संस्कृति माध्यम में बैक्टीरिया विकास है.

संस्कृति और intracellular जीवाणुओं की मात्रा का ठहराव हालांकि TX-100 intracellular जीवाणु नहीं मार सकता है. यह उनके विकास को बाधित कर सकते हैं. जैसे, यह ठोस मीडिया पर डिटर्जेंट की उपस्थिति में बैक्टीरिया प्रतिकृति की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है. कहाँ प्रभावित, यह संभव हो सकता है डिटर्जेंट के कम सांद्रता का उपयोग या सैपोनिन जैसे एक विकल्प का उपयोग हो सकता है. क्रिस्टल बैंगनी धुंधला और माइक्रोस्कोपी परख पर gentamicin संरक्षण परख की एक और लाभ यह है कि कम श्रम गहन है, और यह पता लगाने और भली भाँति जीवाणुओं की उप आबादी के भेदभाव की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए एस. aureus या तो एक सामान्य कॉलोनी (राष्ट्रीय राजधानी क्षेत्र) के प्रकार या छोटे कॉलोनी ^{(SCV) संस्करण} 16, जो व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिकाओं के माइक्रोस्कोपी से अलग पहचाना नहीं होगा उत्पादन कर सकते हैं. क्रिस्टल बैंगनी और gentamicin संरक्षण परख अधिक माइक्रोस्कोपी परख धुंधला का एक लाभ यह है सेल clumping के लिए और है कि intracellular जीवाणु है कि 'एक व्यवहार्य लेकिन गैर कृषि' राज्य पता ^{लगाया} जाएगा 17 दर्ज हिसाब किया जा सकता है.

जीवाणु आक्रमण में मेजबान कोशिका प्रक्रियाओं की भूमिका की जांच करना. कई अध्ययनों से cytochalasin डी, जो actin पुनर्व्यवस्था के साथ हस्तक्षेप के रूप में मेजबान सेल समारोह के inhibitors कार्यरत है. इस तरह के अध्ययन को भी एंटीबॉडी शामिल कर सकते हैं कि लक्ष्य कक्ष सतह रिसेप्टर्स और ^{विशिष्ट} 18 जीनों की siRNA पछाड़ना . यह vitally महत्वपूर्ण है करने के लिए सुनिश्चित करें कि इन उपचार या संवर्धित कोशिकाओं की व्यवहार्यता लगाव को प्रभावित नहीं है या बैक्टीरिया पर विषाक्त प्रभाव है.

भविष्य दिशाओं:

सारांश में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल इसी तरह कई वर्षों से अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण पर आधारित है. यह व्यापक रूप से संवर्धित कोशिकाओं और बैक्टीरियल प्रजातियों के कई प्रकार के लिए लागू है और डेटा की बड़ी मात्रा में उत्पन्न कर सकते हैं जल्दी और अपेक्षाकृत कम लागत पर.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

यह काम वेलकम ट्रस्ट (0795880 WT) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.

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