Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

1. ES Hücreler Kaplama

T = 0 sa
MEF kaplama

1. Tabakanın canlı görüntüleme μ-Slaytlar 8-kuyu (ibidi; Münih, Almanya), jelatin veya odacıklı kapak camları (Lab-Tek, Rochester, NY) ile veya cam alt kültür yemekleri (Mattek; Ashland, MA). 5-30 dakika bekletin ve ücretsiz jelatin uzak aspirat.
2. Tohum 22.000 MEFS / DMEM 250 ul toplam hacmi [% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş]. Hücreler doku kültürü inkübatör (37 ° C,% 5 CO2) büyümesine izin verin.

T = 6 saat
ES hücre kaplama

3. Aspire DMEM.
4. Tohum / ES hücre medya 250 ul toplam hacmi 15.000 R1 hücreleri ile kaplı her MEF [% 10 ESC dereceli fetal sığır serumu (FBS), 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM aminoasitlerin, 0.1 mM β-ile takviye merkaptoetanol, ve 1000 U / ml lösemi inhibitör faktör (LIF)], ertesi gün% 30 -% 50 izdiham elde etmek için.

2. ES Hücreler Transfecting

T = 24 saat
Geçici transfeksiyon

1. 250 ul / kuyu taze ES hücre medya ES hücre ortamı değiştirin.
2. 1.5 ml steril test tüpü, 100 ul serum ücretsiz medya [Opti-MEM (Gibco)], serum serbest ortam içine doğrudan 10 ul transit LT1 transfeksiyon reaktifi (Mirus) ekleyin. Nazik pipetleme ile karıştırın ve 5-20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
3. 1.5 mg GFP füzyon plazmid DNA (H1e, H1o veya HP1) seyreltilmiş transit-LT1 reaktif ekleyin. Nazik pipetleme ile karıştırın ve 15-30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
4. 13.5 ul / kuyu transfeksiyon karışımı ekleyin. Swirl μ-Slaytlar 8-hatta dağılma sağlamak için iyi. 24 saat 250 ul taze ES hücre medya ile eski ES hücre medya değiştirdikten sonra.

3. Sıkı bağlamak ve FLIP Sahne

T = 48-72 saat

1. Deneyde herhangi bir konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) yapılabilir, ancak normal bir sıkı baÄŸlamak / FLIP deneyde bu yana, birçok üst üste görüntüleri elde toplama hızı saÄŸlayan dönen bir disk konfokal mikroskop kullanmak için önerilen ve saÄŸlar dair hiçbir beyazlatma istenmeyen numune ilk kasıtlı beyazlatma olay meydana gelecektir. Burada, Yokogawa CSU-X dönen disk kafası disk konfokal sistemi (www.Andor.com) Devrim iplik kullanmanızı öneririz. Bu sistem bir nokta tarama sistemi ile özel bir FRAPPA modülü kullanarak photobleach çift kapasiteye sahip ve hızla dönen disk kullanarak görüntü toplamak için ışık geri dönmek. Deneyler photobleaching için kullanılan en yaygın 3 floresan proteinleri GFP, YFP ve Kiraz. GFP veya YFP kullanılırsa, bir ~ 488 nm lazer gereklidir. Kiraz, ~ 560 nm lazer kullanın. Tüm durumlarda, katı hal lazerleri kullanmanızı öneririz. Otomatik bir aÅŸamada olması yararlı ancak gerekli deÄŸildir. Canlı hücreler görüntülü olduÄŸundan, (LIS gelen birini kullanıyorsanız, Ä°sviçre) bir kazanı kullanmak için gerekli oksijeni kontrol, nem, CO ₂ ve sıcaklık. Sıkı baÄŸlamak gerekli minimal lazer gücü (genellikle% 10 alan, floresan seviyesi yeterli) ile görüntüleme yapılırken maksimum lazer yoÄŸunluÄŸu kullanılarak yapılır.
   Uygun dalga boyu floresan ışık hücreleri gözlemleyin ve 60X immersiyon yağı lens kullanarak GFP ifade eden bir hücreyi seçin. Doğru hücre içi dağıtım olun. Bazen, ekspresyon düzeyleri çok yüksek, protein lokalizasyonu nükleolus gibi diğer bölmelere 'dökülme'. Bu tür hücreler seçili olmamalıdır.
2. Şimdi bir görüntüleme protokolü ayarlayın: ökromatin veya heterokromatin (yoğun GFP odakları olarak görülüyor) sonra, photobleaching önce photobleach 3-5 kare toplamak ve 250-1000 ms aralıklarla, photobleach sonra 90-120 kare toplamak: H1e-GFP, 1000 ms H1o ve HP1-GFP, 250 ms (zaman aralığı değişiklikleri son derece dinamik proteinler, kısa bir zaman aralığı gerektiren protein dinamikleri, göre). Biz normalde 80-100 lazer yoğunluğu% 20-40 μseconds (1-2 tekrarlamalar) bir lazer darbesi ile photobleaching kullanır, ancak bu sayılar, analiz edilen protein ve ekspresyon seviyeleri göre değiştirebilirsiniz. Photobleaching uygun olduğunda, GFP floresan bir "kara delik" gözlemlemek gerekir. Kara delik giderek floresan aşağıdaki kurtarma yeniden doldurulur. Dönen disk, saniyede 60 görüntü (iyi floresan ve tek bir hücre üzerinde yakınlaştırma) elde edebilirsiniz rağmen, biz, düşük görüntü kalitesi ve potansiyel artışı fototoksisite sayesinde yüksek hızlarda sistem kullanmanızı tavsiye etmiyoruz.
3. FLIP bir deneme için, farklı bir görüntüleme protokolü kurmak, ağartma önce 3-5 kare toplamak sonra görüntüleri toplarken aynı noktada beyazlatma tekrarlanmalıdır. H1e H1o-GFP, çamaşır suyu, GFP, çamaşır suyu, her 5 saniye, her 2 sn ve HP1-GFP çamaşır suyu her 1 sn için. Bleach bird tüm deney boyunca tekrar tekrar görüntüleri toplamak.
4. Her iki teknik için, 20-30 hücreleri üzerinde işlemi tekrarlayın. Istatistiki amaçlar için, tercihen farklı günlerde, deney 3 veya daha fazla kez tekrarlayın. Homojen bir nüfus ve doğru ayarları, standart sapma, genellikle düşük (<% 5).
   Hem sıkı bağlamak ve FLIP için, ağartılmış bölgenin büyüklüğü ve şekli kurtarma dinamiklerini etkiler ve bir deney içinde sabit kalmalıdır. Ayrıca, iki hücre karşılaştırıldığında, aynı protokolleri kullanılan olmalıdır ve hücrelerin güç lazer ve diğer koşulları dalgalanma gösterebilir ve deney sonucunu etkileyebilecek aynı gün sırayla analiz edilmelidir.

4. Sıkı bağlamak ve FLIP Veri Analizi

1. Tüm sıkı bağlamak kare toplanan, floresan yoğunluğu ölçümü ROI (yatırım getirisi _b = ağartılmış alan), arka plan alanı (ROI _bg) ve önce zamanın bir fonksiyonu olarak ve ağartma sonra olmayan ağartılmış nükleer alanı (ROI _nb). Ağartılmış bölgenin ihmal olduğunda tüm çekirdek normalleşme amaçlar için seçilebilir.
2. / (ROI _nb - ROI _bg) - (ROI _bg ROI _b) / (pbROI _b - pbROI _bg) / (pbROI _nb - pbROI _bg), pb önceden ağartılmış ifade eder: her zaman noktası için, formüle göre veri normalleştirmek. -Bleach öncesi görüntüleri için yaklaşık 1 bir değer almalısınız. Çamaşır suyu sonra ilk görüntü Bleach Derinlik gösterecektir. Gerçek Bleach Derinlik değeri için 1 değeri çıkarma. Her hücre ve her bir deney ortalama 20-30 hücreleri için bu işlemi tekrarlayın.
3. Toplanan tüm FLIP kare, olmayan ağartılmış nükleer alanda floresan ve arka alanı (ROI _nb = ağartılmış olmayan alan, YG _bg = arka) ölçer. FLIP veri hesaplanması sıkı bağlamak eğrisine benzer, sadece analiz yatırım getirisi (ROI _nb) hesaplanmasında kullanılan gerçek beyazlatılmış bölge, farklı olmalıdır: (ROI _nb - ROI _bg) / (pbROI _nb - pbROI _bg) . Normalleştirme amaçlı bir komşu hücre (ROI _n = komşu hücre) kullanmak da mümkündür: (ROI _nb - ROI _bg) / (ROI _n - ROI _bg) / (pbROI _nb - pbROI _bg) / (pbROI _n - pbROI _bg .)
   Veri toplama, bilgisayar simülasyonu için deneysel veri sığdırmak mümkün. Bu iyi bir yakınlık, cep fraksiyonu, hareketsiz fraksiyonu ve yarı-maksimum, hesaplama sağlar. Biz burada sıkı bağlamak analizler matematiksel ve istatistiksel yönlerini tartışmak ve diğer mükemmel yayınlar ^4-9 okuyucu bakın olmaz. Çamaşır suyu derinliği önceden çamaşır suyu (% 100), sinyal ve çamaşır suyu sonra ilk görüntü arasındaki mesafe (y ekseni) ifade eder; mobil fraksiyonu çamaşır suyu derinliği ve arasındaki mesafe (y ekseni) ifade eder Kurtarılan sinyal kinetik bir platoya ulaşır ve hareketsiz fraksiyonu kurtarılan sinyal ve ön çamaşır suyu (% 100) sinyal arasındaki mesafe (y-ekseni) (bkz. Şekil 1B ve 2B) ifade eder. Bu analizin ötesinde, veri sığdırmak için iyi bir matematiksel modeller vardır. Tek bir üs, denklem için
   
   t zaman nerede, A, 1-A mobil fraksiyonu hareketsiz fraksiyonu ve k _off sabit ayrışma, veri sığdırmak için kullanılır ve kapalı bağlama oranı doğrudan tahmin edilebilir (k _off) yanı sıra, dernek oranı hesaplamak için kullanılan parametre, elde.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1 A ve B gösterisi temsilcisi sıkı bağlamak eğrileri HP1 (solda), H1o (orta) ve R1 ES hücrelerinin H1e (sağda). Sadelik ve berraklık Şekil için 1A herhangi bir normalleşme ve hesaplama önce tek bir hücre ham verileri gösterir. Sarı eğrisi ağartılmış bölgeye karşılık, mor eğri olmayan ağartılmış nükleer alanı (ağartılmış bölgenin ihmal olduğunda tüm çekirdeği normalleşme amaçlar için seçilebilir) karşılık, kırmızı çizgi olan eşiğe karşılık gelen Bu durumda minimal. Dikey ok çamaşır suyu temsil eder. Normalize ve ortalama veriler Şekil 1B gösterilmiştir. H1 (mavi) HP1 (kırmızı) ile karşılaştırıldığında daha yavaş iyileşme unutmayın. Ayrıca H1e varyant (koyu mavi) H1o varyant (açık mavi) daha yavaştır. Mobil ve sabit kesirler ve Bleach Derinlik HP1 gösterilir.

2. A ve B ökromatin karşılaştırarak göstermek temsilcisi sıkı bağlamak eğrileri (ŞekilR1 ES hücrelerinin HP1 heterokromatin (sağda) ile birlikte) bıraktı. Benzer şekilde Şekil 1, Şekil 2A, tek bir hücrenin ham verileri gösterir, sarı eğrisi ağartılmış bölgeye karşılık, mor eğri olmayan ağartılmış nükleer alana karşılık, kırmızı çizgi eşiğe karşılık gelir. Dikey ok çamaşır suyu temsil eder. Normalize ve ortalama veriler Şekil 2B gösterilmiştir. Heterokromatin (koyu kırmızı) ökromatin (açık kırmızı) ile karşılaştırıldığında daha yavaş iyileşme unutmayın. Mobil ve sabit kesirler ve Bleach Derinlik ökromatin gösterilir.

Şekil 3. H1o R1 ES hücreleri tipik bir FLIP deney Şekil 3A (ham, un normalize veri) ve B (normalize ve ortalama veri) gösterilir. Bu deneyde, mor eğri olmayan ağartılmış nükleer alana karşılık, yeşil hat komşu bir hücre çekirdeğine karşılık gelen ve kırmızı çizgi eşiğe karşılık gelir.

Hücre popülasyonlarının veya sabit hücreleri, sıkı bağlamak deneyler saflaştırılmış kromatin içeren en uygun teknikler, aksine, canlı hücrelerde kromatin protein dinamikleri değişiklikler izleyin. Kromatin protein dinamiği kromatin plastisite için iyi bir gösterge olarak bulundu. Ancak, bu fırınlama, GFP ilgi geninin gerektirdiğinden, floresan etiketinin yanı sıra protein fonksiyonu ile karışabilir. Bu nedenle, sıkı bağlamak geçmeden önce, füzyon proteini titizlikle kendi doğal muhatabı olarak aynı özellikleri ve işlevi vardır emin olmak için test edilmesi gerekir. Altın standart bir nakavt hücre hattı GFP-füzyon ile endojen protein fonksiyonu tamamlayıcı olacaktır. Ancak, nakavt hücre hatları her zaman mevcut değildir ve birçok durumda protein yokluğunda net bir fenotip bulunmamış. Bununla birlikte, tek bir doğru kısmi değişimi sağlamak için endojen protein ile karşılaştırıldığında tüm füzyon proteinin hücre içi dağıtım, ekspresyon seviyesi, bağlayıcı ortakları test edebilirsiniz.

DoÄŸrulandıktan sonra, GFP füzyon proteini ES hücrelerinin içine transfekte olmalıdır. Biz Transit ES hücreleri ile iyi çalışıyor,% 50'nin üzerinde transfeksiyon verimlilik elde bulundu. Geçici transfeksiyon doÄŸrudan deney baÅŸlamadan saÄŸlar uygundur, ancak stabil transfeksiyon genellikle üstün olduÄŸunu, ilgi füzyon proteinin varlığı hücrelerin uzun süreli saÄŸkalım saÄŸlanması ve alt ve homojen bir ifade seviyesi ile sonuçlanır. Ek GFP etiketleri ile proteinler etiketleme yöntemleri kullanarak BACS combineering ¹⁰ veya GFP-yakalama GFP / YFP ekzon ^{11, 12} ile doÄŸrudan endojen genlerin. GFP geninin etiketleme Füzyon proteini bir endojen organizatörü tarafından yönlendirilen, ama her zaman deÄŸil gibi Bu yöntemler tercih edilir. Embriyonik kök hücrelerin içine BACS Transfeksiyon mümkün standart transfeksiyon yöntemleri kullanıyor. Son olarak, transgenik farelerin etiketli kromatin protein ifade ES hücrelerinin de kullanılabilir. Daha hantal olmasına raÄŸmen, bu yöntem, istikrarlı bütünleÅŸme saf seçim ulaÅŸmak için uzun süreli kültür gerektirir stably transfekte hücreler, aksine, erken geçit hücrelerin kullanımına izin verir.

Ilk, ağartılmış floresan sinyal herhangi bir arka plan üzerinde açıkça algılanabilir olmalıdır: ilgi protein seçildikten sonra, GFP ile erimiş doğrulanmış ve ES hücrelerinin içine transfekte, başarılı bir sıkı bağlamak deney için yerine getirilmesi gereken bazı temel koşullar vardır sinyal; ikinci, photobleaching hızlı kurtarma eğrisi analizi için yeterli temporal çözünürlük sağlamak ve kurtarma yarı zamanlı ölçümüne olanak iyileşme dönemine göre olması gerekir. Bu nedenle, beyazlatma için kullanılan lazer, bu duruma izin vermek için yeterince güçlü olmalıdır; üçüncü, izleme ışın photobleaching en aza indirmek için düşük yoğunlukta olmalıdır. Photobleaching yetenekleri (Andor Devrimi sistemi) ile donatılmış bir dönen disk konfokal mikroskop, bu nedenle bu amaç için idealdir. Son olarak, uygun büyüme koşullarında hücreleri tutarak bir çevre odasına doğru hücre homeostazının sağlamak için mikroskop yüklü olması gerekir.

Çekirdek histon analiz önemli bir kısıtlaması DNA sıkıca baÄŸlı olduÄŸunu ve bu nedenle sıkı baÄŸlamak deneylerde hemen hemen hareketsiz görünür. Çekirdek histon tam iyileÅŸme ulaÅŸmak için sıkı baÄŸlamak eÄŸrileri birkaç saat ulaÅŸtırılması gerekmektedir. Embriyonik kök hücrelerin kültür ortamında son derece mobil olduÄŸundan, bu saat süren sıkı baÄŸlamak deneyler gerçekleÅŸtirmek için aslında teknik olarak mümkün deÄŸildir. Bunu önlemek için, bir 10 dakika sıkı baÄŸlamak deneyler gerçekleÅŸtirmek ve dakika saat kinetik davranışı hesapladığım. Kısa yarı ömrü birkaç dakika en fazla ¹ saniye sırada çıkan çekirdek histon aksine, çoÄŸu DNA baÄŸlayıcı proteinler hızla iliÅŸkilendirmek ve kromatin ilgimiz yoktur. Bu yazıda, hem dinamik ES hücrelerinin iki DNA baÄŸlayıcı proteinler, H1 ve HP1 okudu, henüz HP1 H1 (Åžekil 1'de gösterildiÄŸi gibi) daha dinamik. Not, bu kromatin proteinleri heterokromatin, photobleaching sonra bu nedenle floresan kurtarma (Åžekil 2'de görüldüğü gibi) hem daha yavaÅŸ, daha az ökromatin daha heterokromatin dinamiktir. Heterokromatin olarak daha yavaÅŸ bir toparlanma muhtemelen bir H1 ve HP1 için baÄŸlayıcı sitelerinin yanı sıra daha yüksek konsantrasyonda moleküler kalabalık yansıtır.

Özetlemek gerekirse, photobleaching deneyler, pluripotent hücreler abartılı kromatin plastisite yansıtan, canlı hücrelerin kromatin protein dinamiklerini incelemek için araçları sağlar.