Fotobleken Analyses (FRAP & FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen

1. Beplating van de ES-cellen

T = 0 uur
MEF plating

1. De vacht van de live-imaging 8-goed μ-Slides (ibidi, München, Duitsland), met gelatine of in chambered dekglaasjes (Lab-Tek, Rochester, NY) of in glazen bodem cultuur gerechten (MatTek, Ashland, MA). Laat gedurende 5-30 min en zuig weg vrij gelatine.
2. Zaad 22.000 MEF / putje in 250 ui totale volume van DMEM [aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS)]. Laat cellen om te groeien in een weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO2).

T = 6 uur
ES-cel plating

3. Aspireren DMEM.
4. Zaad elke MEF goed bedekt met 15.000 R1 cellen / putje in 250 ui totaal volume van de ES-cel-media [aangevuld met 10% ESC-grade foetaal bovine serum (FBS), 1 mM natrium pyruvaat, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 0,1 mM β- mercaptoethanol, en 1000 U / ml leukemie remmende factor (LIF)], tot 30% tot 50% confluentie het verkrijgen van de volgende dag.

2. Transfecteren de ES-cellen

T = 24 uur
Transiënte transfectie

1. Vervang de ES-cel media met 250 ul / putje van verse ES-cel media.
2. In een 1,5-ml steriele reageerbuis, voeg 100 ul serum-vrije media [Opti-MEM (Gibco)], dan is 10 ul Transit-LT1 transfectiereagens (Mirus) toe te voegen direct in het serum vrije media. Meng door zachtjes te pipetteren en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 50-20 minuten.
3. Voeg 1,5 microgram GFP fusie plasmide DNA (H1E, H1o of HP1) om de verdunde transit-LT1 reagens. Meng door zachtjes te pipetteren en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15-30 minuten.
4. Voeg 13,5 ul / putje van de transfectie mengsel. Swirl de 8-goed μ-Dia's om zelfs verspreiding zorgen. Na 24 uur vervanging van de oude ES-cel media met 250 ul vers ES-cel media.

3. Het uitvoeren van FRAP en FLIP

T = 48-72 uur

1. Het experiment kan worden uitgevoerd op elke confocale laser scanning microscoop (CLSM), maar omdat in een normale FRAP / FLIP experiment, vele opeenvolgende beelden worden verkregen, is het raadzaam om een ​​spinning-disk confocale microscoop, die overname snelheid maakt het gebruik en zorgt ervoor dat er geen ongewenste sample bleken zal optreden na de eerste opzettelijke bleken evenement. Hier raden wij het gebruik van de Revolutie draaiende schijf confocale systeem (www.Andor.com), met de Yokogawa CSU-X draaiende schijf hoofd. Dit systeem heeft de dubbele capaciteit om photobleach behulp van een gespecialiseerde FRAPPA module met een punt scanning systeem, en snel schakelen het licht terug naar beelden met behulp van de draaiende schijf te verzamelen. De drie meest voorkomende fluorescerende eiwitten die gebruikt worden voor fotobleken experimenten GFP, YFP en Cherry. Als GFP of YFP worden gebruikt, is een ~ 488 nm laser nodig. Voor Cherry, gebruik dan een ~ 560 nm laser. In alle gevallen adviseren wij het gebruik van solid state lasers. Met een geautomatiseerd stadium is nuttig maar niet vereist. Omdat levende cellen worden afgebeeld, is het essentieel om een milieu-kamer gebruiken (we gebruiken een van LIS, Zwitserland), controleren zuurstof, vocht, CO ₂ en temperatuur. FRAP is uitgevoerd met behulp van een maximale laser intensiteit, terwijl beeldvorming wordt gedaan met de minimaal benodigde laservermogen (meestal in het gebied van 10%, bij fluorescentie-niveau voldoende is).
   Let op de cellen met tl-licht van de juiste golflengte en selecteert u een cel die GFP met behulp van een 60X olie-immersie lens. Let op de juiste subcellulaire distributie. Af en toe, als expressie niveaus te hoog zijn, kan het eiwit van de lokalisatie 'spill' naar andere compartimenten, zoals de nucleolus. Dergelijke cellen mag niet worden geselecteerd.
2. Nu een imaging protocol: het verzamelen van 3-5 frames voor de photobleaching, dan photobleach op euchromatin of heterochromatine (gezien als gecondenseerde GFP foci) en het verzamelen van 90 tot 120 frames na de photobleach, met 250 tot 1000 ms intervallen: H1E-GFP, 1000 ms, H1o en HP1-GFP, 250 ms (interval tijd verandert al naar gelang het eiwit dynamiek, waar zeer dynamische eiwitten nodig hebben korter interval tijd). We normaal gesproken gebruik van 80-100% laser intensiteit voor fotobleken met een laserpuls van 20-40 μseconds (1-2 herhalingen), maar deze cijfers kunnen veranderen, afhankelijk van de geanalyseerde eiwit en de expressie niveaus. Wanneer photobleaching gepast is, moet u zich aan een "zwart gat" in uw GFP fluorescentie. Het zwarte gat is geleidelijk weer gevuld met fluorescentie na herstel. Hoewel de draaiende schijf kan krijgen voor ongeveer 60 beelden per seconde (met goede fluorescentie-intensiteit en bij het inzoomen op een enkele cel), we raden het gebruik van het systeem op zulke hoge snelheden als gevolg van een lage beeldkwaliteit en mogelijk verhoogde fototoxiciteit.
3. Voor een FLIP experiment, het opzetten van een andere imaging protocol: het verzamelen van 3-5 frames voor het bleken, dan start herhaald bleken op dezelfde plek terwijl het verzamelen van beelden. Voor H1E-GFP, bleekmiddel om de 5 seconden, voor H1o-GFP, bleekmiddel om de 2 sec, en voor het HP1-GFP bleekmiddel om de 1 sec. Bleach eend herhaaldelijk te verzamelen opnamen over het gehele experiment.
4. Voor beide technieken, herhaal het proces op 20 tot 30 cellen. Voor statistische doeleinden, herhaal experiment 3 keer of meer, bij voorkeur op verschillende dagen. In homogene bevolking en de juiste instellingen, de standaarddeviatie is meestal laag (<5%).
   Voor zowel FRAP en Flip, de grootte en vorm van de gebleekte regio beïnvloedt het herstel dynamiek en moet constant blijven binnen een experiment. Ook wanneer twee cellen worden vergeleken, moeten identieke protocollen worden gebruikt en de cellen moeten opeenvolgend worden geanalyseerd op dezelfde dag als power laser-en andere voorwaarden kan fluctueren en kan de uitkomst van het experiment beïnvloeden.

4. FRAP en FLIP Data Analysis

1. In alle FRAP frames verzameld, het meten van de fluorescentie-intensiteit in de ROI (ROI _b = gebleekt gebied), de achtergrond gebied (ROI _bg), en de niet-gebleekte nucleair gebied (ROI _nb) als een functie van de tijd voor en na het bleken. Wanneer de gebleekte regio te verwaarlozen is de hele kern kan worden geselecteerd voor normalisering doeleinden.
2. Voor elk tijdstip, normaliseren van gegevens volgens de formule: (ROI _b - ROI _BG) / (ROI _nb - ROI _BG) / (pbROI _b - pbROI _BG) / (pbROI _nb - pbROI _bg), pb geeft pre-gebleekt. Voor pre-bleach beelden die u moet krijgen een waarde van ongeveer 1. Het eerste beeld na het bleekmiddel geeft de Bleach diepte. Trek de waarde van een voor de actuele Bleach Depth-waarde. Herhaal dit voor elke cel en 20-30 cellen van elk experiment.
3. In alle verzamelde FLIP frames, het meten van de fluorescentie-intensiteit in de niet-gebleekte nucleair gebied, en de achtergrond gebied (ROI _nb = niet-gebleekte gebied, ROI _bg = achtergrond). Berekening van de FLIP-gegevens is vergelijkbaar met een FRAP curve, moet alleen de geanalyseerde ROI (ROI _nb) anders zijn dan de werkelijke gebleekte regio, die niet wordt gebruikt voor de berekening: (ROI _nb - ROI _BG) / (pbROI _nb - pbROI _BG) . Het is ook mogelijk om een naburige cel (ROI _n = buurman cel) te gebruiken voor normalisatie doeleinden: (ROI _nb - ROI _BG) / (ROI _n - ROI _BG) / (pbROI _nb - pbROI _BG) / (pbROI _n - pbROI _bg ).
   Na het verzamelen van gegevens, is het mogelijk passen bij de experimentele gegevens op een computer simulatie. Dit laat berekenen, met een goede nabijheid, de mobiele fractie, de onbeweeglijke fractie en de half-maximum. We zullen hier niet ingaan op de wiskundige en statistische aspecten van FRAP analyses en verwijzen de lezer naar andere uitstekende publicaties ^4-9. Het bleekmiddel diepte verwijst naar de afstand (op de y-as) tussen de pre-bleach (100%) signaal en het eerste plaatje na bleekwater, de mobiele fractie verwijst naar de afstand (op de y-as) tussen het bleekmiddel diepte en de herstelde signaal wanneer de kinetiek een plateau bereikt, en de immobiele fractie verwijst naar de afstand (op de y-as) tussen de herstelde signaal en de pre-bleach (100%) signaal (zie figuren 1B en 2B). Afgezien van deze analyse, zijn er goede wiskundige modellen om de data te passen. Voor een enkele exponent, de vergelijking
   
   waar t is tijd, A is de mobiele fractie, 1-A is de immobiele fractie en k _off is de dissociatieconstante, kan gebruikt worden om de gegevens te passen, en een directe schatting van de off snelheid van binding (k _off) kan zijn verkregen, alsmede voor de parameter A, die gebruikt kan worden om de vereniging te berekenen.

5. Representatieve resultaten:

Figuur 1. A en B tonen vertegenwoordiger FRAP rondingen van HP1 (links), H1o (midden) en H1E (rechts) in R1 ES-cellen. Voor de eenvoud en duidelijkheid Figuur 1A toont de ruwe data van een enkele cel voordat er een normalisering en berekening. De gele curve komt overeen met de gebleekte regio, de paarse curve komt overeen met de niet-gebleekte nucleair gebied (wanneer de gebleekte regio te verwaarlozen is de hele kern kan worden geselecteerd voor normalisatie doeleinden), en de rode lijn komt overeen met de achtergrond fluorescentie, dat is minimaal in dit geval. Verticale pijl geeft het bleekmiddel tijd. Genormaliseerd en gemiddelde gegevens is weergegeven in figuur 1B. Let op de trager herstel van de H1 (blauw) in vergelijking met HP1 (rood). Ook de H1E variant (donkerblauw) is langzamer dan de H1o variant (lichtblauw). Mobiele en immobiele fracties en Bleach diepte zijn geïndiceerd voor HP1.

Figuur 2. A en B tonen vertegenwoordiger FRAP curves vergelijken euchromatin (links) met heterochromatine (rechts) van HP1 in R1 ES-cellen. Net als in Figuur 1, Figuur 2A ruwe data van een enkele cel shows, gele curve komt overeen met de gebleekte regio, paarse curve komt overeen met de niet-gebleekte nucleair gebied, en de rode lijn komt overeen met de achtergrond fluorescentie. Verticale pijl geeft het bleekmiddel tijd. Genormaliseerd en gemiddelde gegevens is weergegeven in figuur 2B. Let op de trager herstel van heterochromatine (donker rood) in vergelijking met euchromatin (licht rood). Mobiele en immobiele fracties en Bleach diepte zijn geïndiceerd voor euchromatin.

Figuur 3.. Een typische FLIP experiment van H1o R1 ES-cellen is weergegeven in figuur 3A (rauw, niet-genormaliseerde data) en B (genormaliseerd en gemiddeld gegevens). In dit experiment de paarse curve komt overeen met de niet-gebleekte nucleair gebied, de groene lijn komt overeen met een naburige celkern en de rode lijn komt overeen met de achtergrond fluorescentie.

Tegenstelling tot de meeste beschikbare technieken, die gezuiverd chromatine betrekken van cel populaties of vaste cellen, FRAP experimenten volgen veranderingen in het chromatine eiwit dynamiek in levende cellen. We vonden chromatine eiwit dynamiek om een ​​goede indicator voor het chromatine plasticiteit zijn. Echter, omdat het vereist het fuseren van de gen van belang met GFP, kan de toevoeging van de tl-tag interfereren met de functie van het eiwit. Dus, voordat u verdergaat met FRAP, moet het fusie-eiwit rigoureus getest worden om te verzekeren dat heeft dezelfde eigenschappen en functie als zijn native tegenhanger. De gouden standaard zou zijn om de endogene eiwit functie aan te vullen met het GFP-fusie in een knock-out cellijn. Echter, knockout cellijnen zijn niet altijd beschikbaar en in veel gevallen het eiwit van de afwezigheid heeft geen duidelijk fenotype. Toch kan een test van de fusie-eiwit van de subcellulaire distributie, de expressie niveau, zijn bindende partners, allen in vergelijking met de endogene eiwit om een ​​goede gedeeltelijke vervanging te garanderen.

Een keer gecontroleerd, moet de GFP fusie-eiwit worden getransfecteerd in ES-cellen. We vonden dat de Transit goed werkt met ES-cellen en bereikt transfectie efficiëntie van meer dan 50%. Transiënte transfectie is handig omdat hiermee verder gaat met het experiment direct, maar stabiele transfectie is vaak beter, waardoor lange termijn overleving van de cellen in de aanwezigheid van het fusie-eiwit van interesse, en resulteert in een lagere en een homogene expressie niveau. Bijkomende wijze van etikettering eiwitten met GFP tags op te nemen GFP-gen tagging in BAC's met behulp van combineering ¹⁰ of GFP-trapping endogene genen direct met GFP / YFP exonen ^{11, 12.} Deze methoden zijn te verkiezen, omdat het fusie-eiwit wordt aangedreven door een endogene promotor, maar niet altijd beschikbaar. Transfectie van BAC in de ES-cellen is het mogelijk met behulp van standaard transfectie methoden. Tot slot kan ES-cellen van transgene muizen die de gelabelde chromatine eiwit ook worden gebruikt. Hoewel meer omslachtig, deze methode staat het gebruik van vroege passage cellen, in tegenstelling tot stabiel getransfecteerde cellen, die op lange termijn nodig hebben om het kweken van zuivere selectie van stabiele integratie te bereiken.

Zodra het eiwit van belang is geselecteerd, versmolten met GFP, geverifieerd en getransfecteerd in ES-cellen, zijn er een aantal essentiële voorwaarden waaraan moet worden voldaan voor een succesvolle FRAP experiment: ten eerste, de fluorescente signaal dat gebleekt moet duidelijk aantoonbaar zijn over een achtergrond signaal, ten tweede, de fotobleken moet snel ten opzichte van de periode van herstel voldoende temporele resolutie bieden voor de analyse van het herstel curve en de meting van de half-time van herstel mogelijk te maken. Daarom moet de laser gebruikt voor het bleken krachtig genoeg zijn om dit toe te staan, in de derde, de monitoring bundel moet van een lage intensiteit te minimaliseren fotobleken. Een draaiende schijf confocale microscoop, uitgerust met fotobleken-mogelijkheden (zoals Andor Revolution-systeem), is dus ideaal voor dit doel. Ten slotte moet een milieu-kamer houden van de cellen op de juiste groeiomstandigheden worden geïnstalleerd op de microscoop om de juiste cel homeostase te garanderen.

Een belangrijke beperking bij het analyseren van kern histon-eiwitten is dat ze stevig zijn gebonden aan DNA, en dus, in FRAP experimenten ze lijken bijna onbeweeglijk. Het bereiken van een volledig herstel van de kern histonen, moet de FRAP curves oplopen tot enkele uren. Aangezien de ES-cellen zijn zeer mobiel in cultuur, is het in wezen technisch onmogelijk uit te voeren uur-lange FRAP experimenten. Om dit te voorkomen, kan een maximaal uit te voeren tot 10 minuten FRAP experimenten en extrapoleren de kinetische gedrag van minuten tot uren. In tegenstelling tot de kern van histonen, de meeste DNA-bindende eiwitten snel associëren en te distantiëren van chromatine, wat resulteert in korte halfwaardetijden in de orde van seconden tot enkele minuten hooguit ^1. In dit artikel bestudeerden we twee DNA-bindende eiwitten, H1 en HP1, zowel dynamisch in ES-cellen, maar HP1 is dynamischer dan H1 (zoals weergegeven in figuur 1). Van de nota, beide chromatine-eiwitten zijn minder dynamisch dan in heterochromatine euchromatin, daarom is de fluorescentie herstel na fotobleken van heterochromatine is trager (zoals te zien in figuur 2). De langzamere herstel in heterochromatine weerspiegelt waarschijnlijk een hogere concentratie van bindingsplaatsen voor H1 en HP1 als moleculair verdringing.

Kortom, fotobleken experimenten voorzieningen te bevatten om chromatine eiwit dynamica studie in levende cellen, als gevolg van chromatine plasticiteit, dat is overdreven in pluripotente cellen.