솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스

Tsui-Ting Ching¹, Ao-Lin Hsu^1,2

¹Department of Internal Medicine, Division of Geriatric Medicine, University of Michigan, ²Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan

1. 세균 농도의 추정을위한 보정 곡선을 수립

이 섹션에서는 C로식이 제한 실험을위한 식품 소스로 사용되며 특정 박테리아 스트레인 (예 : OP50, HT115)의 세균 농도의 추정을위한 방법을 설명합니다 엘레간스. 별도의 교정 곡선은 응력이 사용 각각의 세균에 대해 설립해야합니다.

1. E.의 단일 식민지의 예방 대장균 박테리아 OP50 3 ML 액체 LB의 국물에 LB 한천에 박테리아의 새로운 행진에서 골랐어요.
2. 37 장소 OP50 문화 박테리아가 하룻밤 사이에 성장 ° C 뿌리와이 가능하다는 특징을 가지고있다.
3. (2X, 4X, 8X, 16X, 32x) 야간 문화에서 세균성 정지 시리얼 2 배 dilutions를 준비합니다.
4. 세중의에서 분광 광도계로 600 nm의 각 희석의 흡광도를 (광학 밀도) 측정.
5. 또한 각각의 박테리아 현탁액 백만 배 (1000 배 희석 배) 희석.
6. 100mm의 LB 한천 플레이트에 균등하게 각 희석의 세균성 정지 0.4 ML을 확산.
7. 18~24시간에 대해 37 ° C 배양기에서 OP50와 장소 LB 번호판을.
8. 각 접시에 박테리아 식민지 성장의 개수를 계산합니다. 식민지 카운트는 각 샘플에 대해 ML 당 cfu을 (콜로니 형성 단위)을 계산하는 데 사용됩니다.
9. 측정된 OD ₆₀₀ 값을 OP50 세균 농도 사이의 관계는 세균의 농도 (cfu / ML)의 함수로 OD _{600하려하고} 선형 회귀 분석 (그림 1)을 수행하여 설치하실 수 있습니다.

솔루션 :

1L에 탈이온수를 추가합니다.
압력솥과 실온에서 저장합니다.

2. 고체 판 기반식이 제한 (SDR) 접시의 준비

이 섹션은 고체 판을 기반으로식이 제한 (SDR) 실험에 사용하기 위해 접시의 준비에 대해 설명합니다. 일반적으로, 우리는 고려의 박테리아 농도 1 X 10 ¹¹ cfu / ML 광고 libitum 먹이 조건 1과 같은 X이 방법에 대한 최적의 DR 먹이 조건으로 10 ⁸ cfu / ML. 그러나, 4-6 다른 박테리아의 농도는 SDR과 응답을위한 완벽한 복용량 종속적인 관계를 확립해야 할 수도 있습니다.

1. E.의 단일 식민지의 예방 3 ML 액체 LB의 국물에 대장균 박테리아 OP50.
2. 37 ° C 통에 OP50 문화를 삽입하여 박테리아가 6~8시간에 대한 성장 수 있습니다.
3. 500 ML의 LB의 국물을 포함하는 새로운 플라스크에 OP50 문화를 전송하고, ° C 쉐이크 하루 37 다시 OP50 문화를 놓으십시오.
4. 박테리아 농도 (농도가 파트 1에서 생성된 교정 곡선을 사용하여 계산)를 확인하기 위해 OP50 문화의 OD ₆₀₀ 측정. 적절한 dilutions는 흡광도의 정확한 측정에 필요한 수 있습니다.
5. 20 분 1,500그램에서 원심 분리하여 펠렛 OP50 박테리아.
6. 1 X 10 ¹² cfu / ML의 농도에 박테리아를 Resuspend.
7. 여섯 가지 농도 10 ML 박테리아 문화를 준비 : 1 × 10 ¹² 10 ¹¹ 10 ¹⁰ 10 ⁹ 10 ⁸ 10 ⁷ cfu / ML.
8. 60mm의 중심에 박테리아 문화의 피펫 0.2 ML은 NGM 접시를 확정. 표면 닉스는 한천 플레이트에 버로우에 벌레를 허용 등 피펫 팁과 접시의 표면을 만지지 마십시오.
9. 1 시간 동안 37 ° C 배양기에서 플레이스 번호판입니다.
10. 박테리아의 성장을 체포하기 위해 각 플레이트에 100mg/mL carbenicillin과 50mg/mL kanamycin 10 μL의 10μL을 적용합니다.
11. 4 항생제 - 살해 박테리아의 다른 농도 ° C 나중에 사용하기 위해 (최대 한 달). 함께 저장 플레이트 앞으로 적어도 1-2일 전체 계획의 실험을위한 충분한 접시를 준비하고 저장하는 것이 중요합니다. 전체 실험 접시 같은 배치를 이용하는 것은 바람직합니다.
12. 박테리아의 생존을 확인하려면, SDR 번호판의 일부 박테리아를 긁어과 carbenicillin과 kanamycin과 빈 NGM 접시에 확산. 6~8시간에 대해 37 ° C 배양기에 플레이트를 삽입하고 박테리아의 성장 (어떤 박테리아의 성장이 관찰되지 않을 것입니다)를 확인하십시오.

솔루션

즉시 10 ML의 aliquots의 60mm X 15mm 배양 접시에 액체 NGM를 따르다

3. SDR 실험 설정

이러한 수명 분석 및 불임 프로 파일링, 웜의 시대 - 동기 인구의 준비로 SDR 관련 연구의 대부분 필수적입니다. 다른 연구, 간단하게 식사 제한을 시작하는 SDR 판에 일반 OP50 접시에서 벌레를 전송합니다. 이 섹션에서는 SDR 동물에 대한 수명 분석을 설정하는 프로토콜은 예제로 설명되어 있습니다.

1. OP50 여러 일반 NGM 플레이트에 20-30 reproductively 활성 성인 전송하는 플래티넘 웜 선택기를 사용하십시오. 실험에 필요한 난자의 숫자에 따라 더 많은 성인이 필요할 수 있습니다.
2. ° C 4 시간 동안 달걀 누워 수 있도록 20 접시를 남겨주세요.
3. 접시에서 어른을 제거합니다. 플레이트는 시각 달걀에 대한 검사를해야합니다.
4. 20 접시를 남겨 ° C와 자손이 Late-L4/day 어른 1 단계로 발전 수 있습니다. 보통이 20 N2 야생 타입 웜 3 일이 소요 ° C.
5. 식이 제한을 시작하는 SDR 플레이트에 1 일 성인의 적절한 숫자를 전송합니다.
6. 수명 분석을 위해, 각 SDR 상태에 대한 번호판 10-20 벌레와 6-8 접시 총을 설정합니다.
7. 모든 벌레가 죽었을 때까지 모든 이일 각 웜의 생존을 점수. 그것은 벌레가 음식의 완전한 박탈을 피하​​기 위해 모든 12-48시간 신선한 SDR 플레이트로 전송하는 것이 중요합니다.

4. 대표 결과 :

OD ₆₀₀ 관련 OP50 농도의 추정을위한 대표적인 보정 곡선의 줄거리는 그림 1에 표시됩니다. 라이너 회귀 분석에 의해 생성된 방정식은 OP50 세균 농도 이후의 모든 계산을 위해 사용될 수 있습니다. 그림 2에 표시된 것은 다른 웜 변종의 의미 수명에 만성 SDR 트리 트먼트의 효과를 시금의 예입니다. 파란색 라인은 SDR로 야생 타입의 웜의 보통사람들 종속적인 반응을 나타냅니다. DAF - 16 (mu86)는 SDR 유발 수명 연장에 아무런 영향을 미치지 않습니다 동안 빨간색 선은, SDR의 수명 효과가 부분적으로 drr - 2 오에 의해 억압을 나타냅니다. C.의 수명 분석을 수행하기위한 세부 방법 엘레간스은 이전 문학 ^1-3에 설명되어 있습니다.

그림 1. E.의 추정을위한 보정 곡선의 대표 결과 대장균 OP50 농도. OP50 농도가 측정된 OD ₆₀₀ 값을 함수로 꾸몄다 있습니다. 오차 막대 = SD 숙박 세균성 문화 흡광도 측정하기 전에, 4X, 2X, 1.5x 배속, 16 배속, 32x를 희석하고, 추가로 희석 1,000 X 번 cfu 측정하기 전에했습니다.

그림 2. C. 대표 결과 엘레간스 수명 실험은 (칭 외에서 그림 ^4.) SDR에 대한 응답으로 두 개의 서로 다른 돌연변이 (녹색과 빨간색)와 야생 유형 N2 동물 (파란색)을 비교. 오류 바 = SEM