Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Russian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

1, 1,2

1Department of Internal Medicine, Division of Geriatric Medicine, University of Michigan, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 54.235.20.17, User IP: 54.235.20.17, User IP Hex: 921375761

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

Ching, T., Hsu, A. Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (51), e2701, doi:10.3791/2701 (2011).

Abstract: Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

Сокращение потребления пищи без недоедания или голода как известно, увеличивает продолжительность жизни и замедления наступления различных возрастных заболеваний в широком диапазоне видов, в том числе млекопитающих. Это также приводит к снижению массы тела и плодородия, а также более низкие уровни глюкозы в плазме крови, инсулина и IGF-1 у этих животных. Это лечение часто упоминается как диетические ограничения (DR) или ограничение калорийности (CR). Элеганс нематоды Caenorhabditis стала важным организма модель для изучения биологии старения. Оба экологические и генетические манипуляции были использованы для модели DR и показали продлить продолжительность жизни C. Элеганс. Однако многие из сообщили DR исследования в С. Элеганс было сделано путем распространения животных в жидких средах, в то время как большая часть генетических исследований старения поле были сделаны на стандартных твердых агара в чашках Петри. Здесь мы приводим протокол DR с использованием стандартных твердых NGM агар основе пластины с убитых бактерий.

Protocol: Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

1. Создание калибровочной кривой для оценки концентрации бактерий

В этом разделе описывается метод оценки концентрации бактерий для любого данного штамма бактерий (например, OP50, HT115), который будет использоваться в качестве источника пищи для экспериментов Диетические ограничения на языке C. Элеганс. Отдельные калибровочные кривые должны быть установлены для каждого штамма бактерий используется.

  1. Привить единственная колония E. кишечной бактерии OP50 выбрать из свежих полоса бактерий на LB агар в 3 мл жидкого бульона LB.
  2. Место OP50 культуры в 37 ° C шейкере и позволяют бактериям расти быстро.
  3. Подготовка серийного 2-кратный разведения бактериальной суспензии из ночной культуры (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
  4. Измерить абсорбцию (оптической плотности) каждого разведения при 600 нм на спектрофотометре в трех экземплярах.
  5. Далее разбавленный каждой бактериальной суспензии 1000000 раз (1000-кратного разбавления дважды).
  6. Распространение 0,4 мл бактериальной суспензии каждого разведения ровно на 100 мм пластины агара LB.
  7. Место LB пластины с OP50 в 37 ° C инкубаторе в течение 18-24 часов.
  8. Подсчитайте количество бактериальных колоний, выросших на каждой пластине. Колония насчитывает используются для расчета КОЕ (колониеобразующих единица) на мл для каждого образца.
  9. Соотношение полученных OD 600 ценности и OP50 бактерий концентрации могут быть созданы путем построения OD 600 в зависимости от концентрации бактерий (КОЕ / мл) и выполняя анализ линейной регрессии (рис. 1).

Решения:

Отвар Лурия (LB), 1л:
10 г Бакто-триптон
5 г Дрожжевой экстракт
10 г NaCl

Добавить деионизированной воды 1л.
Автоклавы и хранить при комнатной температуре.

2. Подготовка твердой пластиной, основанных на пищевых ограничений (SDR) пластин

В этом разделе описывается подготовка пластин для использования в твердой пластиной основанных на пищевых ограничений (СДР) экспериментов. Как правило, мы считаем, бактерий концентрации 1 х 10 11 КОЕ / мл, как вволю кормления состоянии и 1 х 10 8 КОЕ / мл в качестве оптимального кормления DR условием для этого метода. Тем не менее, 4-6 различных концентраций бактерий могут быть необходимы для создания полной зависимости от дозы отношений для SDR и его ответы.

  1. Привить единственная колония E. Coli OP50 бактерий в 3 мл бульона LB жидкости.
  2. Место OP50 культуры в 37 ° C шейкере и позволяют бактериям расти в течение 6-8 часов.
  3. Передача OP50 культуру новых колбу, содержащую 500 мл LB бульоне, и место OP50 культуры еще в 37 ° C шейкер в одночасье.
  4. Измерить диаметр 600 из OP50 культуры для определения бактерий концентрации (концентрации рассчитывается по калибровочной кривой, генерируемых в часть 1). Соответствующие разведения могут быть необходимы для точного измерения оптической плотности.
  5. Гранул OP50 бактерий центрифугированием при 1500 г в течение 20 минут.
  6. Ресуспендируют бактерий к концентрации 1 х 10 12 КОЕ / мл.
  7. Подготовка 10 мл культуры бактерий в шести различных концентраций: 1 х 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 КОЕ / мл.
  8. Пипетка 0,2 мл культуры бактерий в центре 60 мм затвердевших NGM пластины. Не прикасайтесь к поверхности пластины с пипетки, а ники на поверхности позволяют червей зарываются в агар пластин.
  9. Место плит в 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
  10. Применяют 10 мкл из 100мг/мл карбенициллин и 10 мкл 50мг/мл канамицин для каждой пластины для ареста рост бактерий.
  11. Магазин пластины с различными концентрациями антибиотиков убитых бактерий при температуре 4 ° C для дальнейшего использования (до одного месяца). Важно подготовить и хранить достаточно пластин для всего планируемого эксперимента, по крайней мере 1-2 дней вперед. Используя ту же партию пластин в течение всего эксперимента является предпочтительным.
  12. Чтобы проверить жизнеспособность бактерий, очистить некоторые бактерии из SDR тарелки и разложил ее на пустую тарелку NGM с карбенициллин и канамицина. Место пластины в 37 ° C инкубаторе в течение 6-8 часов, а затем проверить для роста бактерий (нет роста бактерий должны быть соблюдены).

Решения

Нематоды Рост Медиа (НГО), 1л:
3 г NaCl
2,5 г Бакто-пептон
20г Агар
ove_content "> Автоклав в течение 40 минут и дайте остыть до 65 ° С, затем добавить:

1 мл 1 М MgSO 4
1 мл 1 М CaCl 2
1 мл 5 мг / мл Холестерин
25 мл 1М фосфата калия, рН 6,0

Сразу же вылить жидкость NGM на 60 мм х 15 мм чашки Петри в 10 мл аликвоты

3. Настройка SDR экспериментов

На протяжении большей части SDR-соответствующих исследований, таких как жизнь анализ диапазона и плодородия профилирования, подготовка возрастных синхронизированы населения червей имеет важное значение. Для других исследованиях, просто перенести червей регулярные OP50 пластины пластины SDR инициировать диетических ограничений. В этом разделе, протокол о создании анализ продолжительности жизни для животных СПЗ описывается как пример.

  1. Использование выбора платинового червь для передачи 20-30 репродуктивно активных взрослых на несколько регулярных пластин NGM с OP50. В зависимости от числа яиц, необходимых для экспериментов, более взрослые могут быть необходимы.
  2. Оставьте пластин при 20 ° С в течение 4 часов, чтобы позволить откладки яиц.
  3. Удалить взрослых от пластинки. Плиты должны быть визуально проверены на яйца.
  4. Оставьте пластин при 20 ° С и позволяют потомства, чтобы развиться в Late-L4/day 1 взрослый этап. Обычно это занимает 3 дня для N2 диких червей типа при температуре 20 ° C.
  5. Передача подходящее число 1-й день взрослым на пластине SDR инициировать диетических ограничений.
  6. Для анализа продолжительности жизни, создать в общей сложности 6-8 пластин с 10-20 червей на пластине для каждого условия SDR.
  7. Оценка жизнеспособности каждого червя каждые 2 дня, пока все черви умерли. Очень важно, что черви быть переданы на свежий пластин SDR каждые 12-48 часов, чтобы избежать полного лишения пищи.

4. Представитель Результаты:

Показанный на рисунке 1 представлена ​​зависимость кривой представитель калибровки для оценки OP50 концентрации по отношению к OD 600. Уравнение порожденных лайнер регрессионного анализа могут использоваться для всех будущих расчетов OP50 бактерий концентрации. Показанный на рисунке 2 является примером опробование эффект хронического лечения SDR на среднюю продолжительность жизни различных штаммов червя. Синяя линия представляет нормальную дозозависимый ответ дикого типа червей SDR. Красная линия показывает, что влияние продолжительности жизни SDR частично подавлены СРБ-2 э, в то время как DAF-16 (mu86) не оказывает влияния на SDR-индуцированной расширение жизни. Подробности метода для проведения анализа в продолжительности жизни C. Элеганс описана в предыдущей литературе 1-3.

Рисунок 1
Рисунок 1. Представителю результате калибровочной кривой для оценки Е. Coli OP50 концентрации. OP50 концентрации строится в зависимости от измеряемой величины OD 600. Планки погрешностей = SD Ночь бактериальной культуры разбавляли 1.5x, 2x, 4x, 8x, 16x, 32x до измерения абсорбции, а затем разводят 1000 х дважды, прежде чем измерение КОЕ.

Рисунок 2
Рисунок 2. Представителю результате C. Элеганс жизни эксперимент сравнения дикого типа N2 животных (синий) с двумя различными мутантами (зеленый и красный) в ответ на SDR (Рисунок из Цзин и соавт. 4). Планки погрешностей = SEM

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

Диетические ограничения (DR), как известно, увеличивает продолжительность жизни и замедления наступления различных возрастных заболеваний в широком диапазоне видов, включая млекопитающих, 5-7. Оба экологические и генетические манипуляции были использованы для модели DR на C. Элеганс, в том числе культивирование червей в полу-определены жидкой среде 8,9, размывание бактериальных источников пищи в жидкую среду 10-12, а также использование поведении мутантов, которые питаются более медленными темпами, 13. Тем не менее, генетические имитирует ДР может привести к фенотипы, которые не связаны в ДР, а культивирование червей в жидкой среде, включает в себя условия роста, которые отличаются от твердой среде условия пластины адаптированы большинстве лабораторий червя. Протокол DR, проведенных на стандартных твердых пластин бы полезно, и поэтому был разработан несколько групп 4,14,15.

В протокол, описанный здесь, бактерии погибают при применении двух различных антибиотиков для пластин, как способ контроля уровня от приема пищи. Тем не менее, альтернативные методы, такие как ультрафиолетовое облучение также может быть использован для подавления роста бактерий.

Чтобы избежать полного лишение пищи (например, голод), в ходе экспериментов SDR, червей необходимо перенести на свежий пластин SDR каждые 12-48 часов, как указано выше в пункте 3.7. Частота передачи зависит от концентрации пищи, количество червей на пластину, и количество потомства червем штамм, используемый в эксперименте. Например, черви могут быть переданы через каждые 48 часов, когда 20 стерильных CF512 [фер-15 (B26), ПЭМ-1 (hc17)] животные были помещены на SDR пластины, содержащей 1 х 10 7 КОЕ / мл OP50 бактерий. Частота передачи должна определяться путем изучения, до эксперимента, как долго SDR пластин может продолжаться до посеяны бактериальных полностью потребляются червей в экспериментальных условиях. При проведении экспериментов, которые последние несколько недель (например, срок службы анализа) с нестерильных напряжения, 50μg/ml ФУДР могут быть добавлены к SDR пластины до 3,5 шаг для устранения откладки яиц. В противном случае, черви должны быть переданы на свежий пластин гораздо чаще, чтобы избежать полного истощения продовольствия из-за их потомства.

Хотя не существует определенный лимит на количество червей, которые могут быть помещены на пластины в эксперименте SDR, размещение более 20 животных на пластине может вызвать трудности в выигрыше жизнеспособность анализ продолжительности жизни после SDR лечения. Стоит также отметить, что SDR может быть начато уже в 1-й день совершеннолетия. Тем не менее, начало SDR на ранних личиночных стадиях развития, может стать причиной ареста в определенных обстоятельствах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements: Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

Эта работа была поддержана пилот награду от центра Натан Шок (P30 AG13283) и R01 гранта (R01 AG028516) из Национального института старения (NIA) А.-LH

Materials: Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin Duchefa Biochemie C0109.25 Dissolved in water.
Kanamycin Roche Group 10106801001 Dissolved in water.
Bacto-peptone BD Biosciences DF0118072
Bacto-tryptone BD Biosciences DF0123075
Bacto-yeast extract BD Biosciences DF0127071
Agar BD Biosciences DF00145170
Sterile culture tube USA Scientific, Inc. 1485-0810
Spectrophotometer Amersham Gene Quant pro Amersham is now part of GE Healthcare.
Dissecting Microscope Carl Zeiss, Inc. Stemi 2000
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Accuspin FR

References: Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

  1. Hsu, A. L., Murphy, C. T. & Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science300, 1142-1145 (2003).
  2. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A. & Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature 366, 461-464 (1993).
  3. Apfeld, J. & Kenyon, C. Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature 402, 804-809 (1999).
  4. Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L. & Hsu, A. L. drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Aging Cell 9, 545-557 (2010).
  5. Weindruch, R. & Walford, R. The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction. (Thomas, 1988).
  6. Masoro, E. J. Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life. Sci Aging Knowledge Environ 2003, RE2 (2003).
  7. Masoro, E. J. Overview of caloric restriction and ageing. Mech Ageing Dev 126, 913-922 (2005).
  8. Houthoofd, K. et al. Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol 37, 1371-1378, doi:S0531556502001730 [pii] (2002).
  9. Houthoofd, K. et al. No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol 37, 1359-1369, doi:S0531556502001729 [pii] (2002).
  10. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech Ageing Dev 6, 413-429 (1977).
  11. Bishop, N. A. & Guarente, L. Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans. Nature 447, 545-549 (2007).
  12. Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J. & Dillin, A. PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans. Nature 447, 550-555 (2007).
  13. Lakowski, B. & Hekimi, S. The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 13091-13096 (1998).
  14. Kaeberlein, T. L. et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell 5, 487-494 (2006).
  15. Greer, E. L. et al. An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans. Curr Biol 17, 1646-1656 (2007).

Ask the Author: Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter