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实心板为基础的饮食限制在线虫

1, 1,2

1Department of Internal Medicine, Division of Geriatric Medicine, University of Michigan, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan

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Cite this Article: 实心板为基础的饮食限制在线虫

Ching, T., Hsu, A. Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (51), e2701, doi:10.3791/2701 (2011).

Abstract: 实心板为基础的饮食限制在线虫

没有营养不良或饥饿，减少食物的摄入，增加寿命和延迟发病的各种与年龄有关的疾病，在广泛的物种，包括哺乳动物。这也导致在体重和生育能力下降，以及血浆葡萄糖，胰岛素和IGF - 1在这些动物的较低水平。这种治疗方法通常被称为饮食限制（DR）或热量限制（CR）。 线虫已经成为一个重要的模式生物，研究衰老的生物学。环境和遗传操作已被用于模型的DR，并已显示出在 C的寿命延长线虫 。但是，许多报道DR 在 C的研究线虫是通过在液体介质中传播的动物，而在老龄问题领域的遗传研究的最标准在固体琼脂培养皿板。在这里，我们目前使用标准的固体NGM杀害细菌的琼脂板DR的协议。

Protocol: 实心板为基础的饮食限制在线虫

1。细菌浓度的估计建立校准曲线

本节描述为任何给定的菌种（如OP50，HT115），将作为食物来源C.限制饮食实验使用细菌浓度的估算方法线虫 。每一株用于细菌，应建立单独的校准曲线。

  1. 接种单菌落的E.大肠杆菌 OP50细菌捡到3毫升的液体LB培养基中的细菌从一个新鲜的LB琼脂连胜。
  2. 广场OP50文化在37℃摇床，并允许细菌的生长过夜。
  3. 准备从过夜培养的菌悬液的序列的2倍稀释（2X，4X，8X，16X，32X）。
  4. 一式三份分光光度计在600 nm测量吸光度（光密度），每个稀释度。
  5. 进一步淡化每个菌悬液百万倍（两次稀释1000倍）。
  6. 传播0.4毫升细菌悬浮液，每个稀释度100毫米的LB琼脂平板上均匀地。
  7. OP50在37℃培养箱中培养18-24小时发生的LB平板。
  8. 计数每盘上生长的细菌菌落的数量。用于计算每个样本菌落计数每毫升CFU（菌落形成单位）。
  9. 测OD 600值和OP50细菌浓度之间的关系可以建立绘制外径 600细菌浓度（CFU / ml为）的功能，并执行线性回归分析（图1）。

解决方案：

卢里亚肉汤（LB），1L：
10克细菌用的蛋白胨
5克酵母提取物
10克氯化钠

加入去离子水至1L。
高压灭菌器，并在室温下储存。

2。固体板为主的饮食限制（SDR）板的制备

本节介绍了编制固体板为主的饮食限制（SDR）的实验中使用的板材。通常情况下，我们认为细菌浓度为1 × 10 11 CFU / ml为自由采食的饲养条件和1 × 10 8 CFU / ml为最优的DR这种方法喂养的条件。然而，4-6浓度不同的细菌，可能需要建立一个完整的剂量依赖关系，SDR和它的响应。

  1. 接种单菌落的E. 3毫升液体LB培养基中的大肠杆菌OP50细菌。
  2. 放置在37℃摇床OP50文化，使细菌的生长为6-8小时。
  3. OP50文化转移到一个新的烧瓶中含500 mL LB培养基中，放置在37℃摇床OP50文化过夜。
  4. 测量外径600 OP50文化，以确定细菌浓度（使用第1部分中所产生的校准曲线的浓度计算） 。吸光度的准确测量，可能需要适当稀释。
  5. 佩莱OP50细菌离心20分钟，在1500克。
  6. 浓度1 × 10 12 CFU / ml为重悬细菌。
  7. 准备在6个不同浓度10毫升细菌文化：1 × 10 12 10 11 10 10 10 9 10 8 10 7 CFU /毫升。
  8. 加入0.2 mL的细菌培养成一个60毫米的中心凝固NGM的板块。避免接触枪头板的表面，表面上的刻痕允许进入琼脂平板蠕虫洞穴。
  9. 1小时37 °彗星孵化器板。
  10. 将10μL的100mg/mL羧和10μL50mg/mL卡那霉素，每块板，以阻止细菌的生长。
  11. 商店板与不同浓度抗生素杀害细菌在4 ° C以供将来使用（一个月）。重要的是整个计划实验的准备和储存足够板提前至少1-2天。使用同一批次的整个实验板是可取的。
  12. 要验证的细菌的生存能力，刮去一些细菌的SDR板和传播与羧苄青霉素和卡那霉素的空NGM板。板放置在37 °彗星孵化器为6-8小时，然后检查细菌的生长（无细菌生长，应遵守）。

解决方案

线虫的生长介质（NGM），1L：
3摹氯化钠
2.5摹细菌用的蛋白胨
20克洋菜
ove_content“>高压灭菌40分钟，放凉至65 ° C，然后添加：

1毫升 1个M硫酸镁4
1毫升 1个M氯化钙2
1毫升 5 mg / mL的胆固醇
25毫升 1M磷酸钾，pH值6.0

立即倾注到60毫米× 15毫米培养皿在10毫升分装液体NGM

3。设置SDR实验

对于大多数的SDR相关的研究，如寿命分析和生育率分析，一个时代同步的蠕虫病毒的人口的准备，是至关重要的。对于其他研究中，简单地转移从一个普通的OP50板的蠕虫SDR板开始限制饮食。在本节中，设立SDR动物寿命分析的协议被描述为一个例子。

  1. 使用铂金蠕虫选择器转移OP50 20-30繁殖到几个经常NGM的板块活跃的成年人。根据实验所需的鸡蛋的数量，需要更多的成年人可能。
  2. 离开板块在20 ° C为4个小时，让产蛋。
  3. 从盘子中取出的成年人。板材应目视检查鸡蛋。
  4. 离开板块在20℃，让后代发展成Late-L4/day 1成人阶段。通常，这需要3天时间为N2野生型蠕虫病毒在20 ° C。
  5. SDR板转移到适当数量的第1天成人开始限制饮食。
  6. 寿命分析，建立了6-8板，每盘10-20蠕虫每个SDR条件。
  7. 分数每个蠕虫的生存能力，每2天，直到所有的蠕虫已经死亡。至关重要的是，蠕虫病毒被转移到新鲜SDR板，每12-48小时，以避免食物完全剥夺。

4。代表性的成果：

在图1所示是一个外径600 OP50在浓度估计为代表的校准曲线图。通过线性回归分析方程，可用于未来OP50细菌浓度计算。在图2所示是化验慢性SDR治疗效果上不同的蠕虫病毒株的平均寿命的一个例子。蓝线代表正常的野生型蠕虫特别提款权的剂量依赖性反应。红线表示，部分由DRR - 2 OE抑制SDR寿命的影响，而DAF - 16（mu86）并没有对SDR -诱导寿命延长的效果。执行C.寿命分析的详细方法线虫是在以往的文献1-3。

图1
代表性的结果为E 的估计校准曲线图1。 大肠杆菌 OP50浓度。 OP50浓度绘制测OD 600值的函数。误差棒= 1.5X，2X，4X，8X，16X，32X的SD隔夜细菌培养前测吸光度稀释，CFU测量前进一步稀释1000倍的两倍。

图2
图2 A C.代表性的结果。 线虫寿命的实验比较野生型N2动物（蓝色）特别提款权（青等。图4）与两个不同突变（绿色和红色）。误差线=扫描电镜

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Discussion: 实心板为基础的饮食限制在线虫

饮食限制（DR）是已知的，以增加寿命和延迟在广泛的物种，包括哺乳动物5-7中各种与年龄有关的的疾病的发病。已用于环境和遗传操作模式在 C DR 线虫，包括在定义一个半液体介质中8,9，稀释10-12日在液体介质中的细菌的食物来源和使用行为的突变体，饲料以较慢的速率13培养蠕虫。然而，DR的遗传模拟可能产生的表型无关的DR，而在液体培养基中培养的蠕虫涉及从固体培养基平板适应大部分的蠕虫病毒实验室的条件不同的生长条件。标准固体板DR的协议将是有益的，因此已被4,14,15几组。

在这里所描述的协议，细菌被杀死作为一种方法来控制食物摄入量的水平，通过应用两个不同的抗生素板块。然而，如紫外线照射的替代方法也可以用来抑制细菌的生长。

为了避免在SDR的实验过程中完全剥夺食物（如饥饿），蠕虫需要被转移到新鲜SDR板上面的步骤3.7中提到的每12-48小时。传输频率取决于食物浓度，每盘蠕虫数量，由实验中所用的蠕虫病毒株产生的后代的数量。例如，蠕虫可将每48小时20无菌CF512 [FER - 15（B26）; FEM - 1（hc17）]动物被置于含有1 × 10 7 CFU / ml为OP50细菌在特别提款权板。通过研究，实验中，种子细菌之前完全是由实验条件下的蠕虫使用特别提款权板可能会持续多久之前，应确定传输频率。当表演，过去几个星期（如寿命分析）与非无菌应变，50μg/mlFUDR可能被添加到SDR板3.5步骤，以消除产蛋前的实验。否则，蠕虫将被转移到新鲜板更加频繁，以避免由于他们的后代的食物完全枯竭。

虽然没有每盘可放置在特别提款权的实验，把20％以上的板块动物蠕虫的数量设置限制，可能会导致在得分寿命分析的可行性，SDR治疗的困难。这也是值得注意的，SDR可每日1次，成年的早期启动。然而，在早期幼虫阶段SDR的启动可能会导致在某些情况下，发展逮捕。

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Disclosures: 实心板为基础的饮食限制在线虫

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements: 实心板为基础的饮食限制在线虫

这项工作是支持到A - LH从弥敦道冲击中心（P30 AG13283）和授予R01（R01 AG028516）从国家老化研究所（NIA）的试点奖

Materials: 实心板为基础的饮食限制在线虫

Name Company Catalog Number Comments
Carbenicillin Duchefa Biochemie C0109.25 Dissolved in water.
Kanamycin Roche Group 10106801001 Dissolved in water.
Bacto-peptone BD Biosciences DF0118072
Bacto-tryptone BD Biosciences DF0123075
Bacto-yeast extract BD Biosciences DF0127071
Agar BD Biosciences DF00145170
Sterile culture tube USA Scientific, Inc. 1485-0810
Spectrophotometer Amersham Gene Quant pro Amersham is now part of GE Healthcare.
Dissecting Microscope Carl Zeiss, Inc. Stemi 2000
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Accuspin FR

References: 实心板为基础的饮食限制在线虫

  1. Hsu, A. L., Murphy, C. T. & Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science300, 1142-1145 (2003).
  2. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A. & Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature 366, 461-464 (1993).
  3. Apfeld, J. & Kenyon, C. Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans. Nature 402, 804-809 (1999).
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  9. Houthoofd, K. et al. No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol 37, 1359-1369, doi:S0531556502001729 [pii] (2002).
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