フローサイトメトリーによる肺および肺リンパ節の分析とマウスの非外科的気管内注入

1。プロセスの前に、以下の項目を準備して収集する

1. 手順の実行中にマウスを抑制するために木製のプラットフォームを構築するための）は図1aの画像）と1bを参照してください。
2. リンパ節のための消化ミックス - HBSS + 1.25mg/mlコラゲナーゼTypeIVまたは2.5 mg / mlのコラゲナーゼD
3. 肺のための消化ミックス - HBSS + 1 mg / mlのコラゲナーゼ
4. LDLNsを可視化するために腹腔内注射のためにPBS中にラテックスビーズを（1:20）で希釈

注：LDLNsを見つけるのは小さいと難しいです。それらを見つける方法を学ぶために、マウスに赤色蛍光ラテックスビーズは、IP希釈1:20の200μlの注入。腹膜は、これらのLDLNs ⁸に排出されます。 24 HPIは、前述のようにマウスの胸腔を公開。 LDLNsは腹膜腔から排出ビーズからピンク色表示になります。

5. 赤血球（RBC）のLysis Buffer - 0.15M NH _{4 Clを} 、10mMのKHCO _3、0.1mMの硫酸_{ナトリウム} 1LのdH ₂ 0 EDTA。 7.2から7.4にpHを調整し、室温で保管。
6. 70μmまたは100μmのセルストレーナー
7. 0.5M EDTAのストック溶液は、pH = 8.0
8. CaCl ₂とMgCl _2をなしHBSS
9. はさみと平滑末端鉗子
10. 喉頭鏡
11. 角度で強制経口投与の針（22ゲージ）曲げ（図2）
12. 発泡スチロールボードとマウスを拡散するためのピン
13. トップパンのバランス
14. アニリンブルー溶液- H ₂ Oで10mg/ml

注：我々はそれ注入技術の実証のためのこのソリューションを使用する。

2。マウス麻酔の準備と管理

1. 最終濃度がそれぞれ2mg/mlと10mg/mlとなるように滅菌PBSでキシラジンとケタミンの混合物を準備します。
2. トップパンのバランスの上でマウスを量る。
3. それぞれのマウスに必要な用量を計算する。キシラジン（2-4 mg / kg体重）とケタミン（70〜80 mg / kg）を体重で投与量は準備された混合物の適切な量を使用しており、intaperitoneallyを注入する。各マウス系統は、麻酔薬の最適化が必要な場合があります。あまりにも多くの麻酔薬を投与したマウスは、接種を肺に注入された後に致命的になる可能性が減少した呼吸速度を持つことができます。
4. 3-5分後、麻酔の効果のためのマウスを観察。マウスが完全に麻酔であることを確認するために、次の標識を確認してください：
   1. 呼吸速度が遅くなるはず。
   2. 首が拾ったときにマウスがその腕を伸ばしてはいけません。
   3. 後肢が刺激されているすべての応答があってはいけません。
      これらの基準が満たされていない場合、数分間待つと次のステップに進む前にもう一度確認してください。

3。気管内注入

1. 50μlの生理食塩水でinnoculumを準備します。 innoculumと無菌ベントの強制経口投与の針を備えた1ミリリットル注射器を埋める。注射器は、流体のすべてが肺に注入されるようにinnoculum背後に100μlのエアポケットをロードする必要があります。
2. ワイヤ上の切歯がぶら下がって斜め木製の台の上にマウスを置き、そっとリボンの部分のある場所でそれを抑制する。
3. 左手で喉頭鏡をオンにする（あなたは右利きの場合）と平滑末端ピンセットをつかむ。そっと口を開く詮索する喉頭鏡と鉗子の先端を使用してください。
4. 鉗子で、舌を引き出し、側にそれを保持する。口の奥に向かって喉頭鏡のブレードをガイド。あなたが気管の開口部が表示されるまで、90 °の角度で非常に穏やかに押された喉頭鏡を保持。場所で喉頭鏡を保持する。口から舌を引っ張るとは組織の損傷が発生しないので、これは穏やかに行われる必要がある場合は注意が必要です。
5. 針の曲がりが正面切歯がなるまで、もう片方の手で、あなたの右の手で曲げ胃管栄養針を備えたinnoculumを含む1ミリリットル注射器を、取ると気管に針を挿入する。 innoculumを提供するために均等にプランジャーを押してください。 innoculumはバブルではないはずです。できるだけ早く気管の針を引き抜きます。マウスは呼吸ができなくなると気管が長時間ブロックされていれば死んでしまう。 innoculumが肺に吸入できるようにするために数秒間直立マウスを押したまま。
6. プラットフォームのノックアウトマウスを取り出し、加熱ランプの近くに置きます。長時間直接加熱マウスを放置しないでください。マウスは、プロシージャ（回復時間は菌株によって異なる場合があります）後30分以内に完全に目覚めでなければなりません。マウスはこの期間中に熱心に観察されるべきであると、熱過ぎたり冷た過ぎたりすることは許されないこれはまた、死に至る呼吸困難にマウスを置くことができます。

4。フローサイトメトリーのための収穫と処理肺所属リンパ節と肺

1. AVMAの安楽死ガイドラインに従って目的のメソッドを使用してマウスを生け贄に捧げる。これは、個々の収穫の成果によって異なる場合があります。ペントバルビタールナトリウムの致死行うの管理は、適切な安楽死の手順の例です。我々はCO ₂で安楽死の否定的な肺の効果を見ていない。
2. 解剖ボード上の腕と脚を固定する。はさみと腹側の中央に沿って切開を加えます。お肌を引っ張ると胸壁の筋肉を公開。
3. 腹部の臓器を公開する胸壁の筋肉を通して切開を加えます。
4. 鉗子や穿刺ダイアフラムと胸骨の先端を保持する。胸郭の側面に沿って振動板をカット。
5. 解剖の基板面に平行なはさみは、両側の背腹のラインに沿って胸腔カットスルーで。
6. わずかに胸郭を持ち上げる。心臓の右側に、ちょうど胸腺の下に、二つのリンパ節を探します。少し大きめの第三リンパ節は気管に垂直に動作する小動脈の血管の下に位置しています。収穫のリンパ節リンパ節消化ミックス1mlに。
7. リンパ節を採取した後、ピンセットで心臓を保持し、別の肺をつかむ。 6ウェルプレートに、氷冷PBSの3ミリリットルに収穫の肺。
8. 、肺の葉を分離するPBSを吸引し、鉗子や鋏を使用して小片に葉を切る。肺のための消化ミックスの3ミリリットルを追加。このステップの間に氷の上で6 - ウェルプレートを保管してください。
9. 37℃で30分25-30分と肺のリンパ節をインキュベート℃に氷上に反応し、場所を停止する消化混合物の各々に10mMの最終濃度にEDTAを追加。
10. 3ミリリットル注射器を使用して、18GA針を通して3回肺の部分を渡します。マッシュ1ミリリットル注射器のプランジャーのバックエンドを使用して70 -100μmのセルストレーナーを通って肺とLNSの作品。のCa ²なしHBSS 10mlの⁺およびMg ^{2 +}を持つセルストレーナーを洗浄してください。 5分間、500 × gで遠心する。
11. RBC溶解バッファー5mlにペレットを再懸濁し、室温で3分間インキュベート。のCa ²なしHBSS 10mlのを追加する⁺およびMg ^{2 +}溶解して急冷する。 5分間、500 × gで遠心する。それぞれ10ミリリットルと5ミリリットルに肺とLDLN単一の細胞懸濁液を立ち上げます。トリパンブルー排除により、血球計を用いて生細胞を数える。セルはフローサイトメトリーのために染色する準備が整いました。肺の1葉は、フローサイトメトリーのための十分な場合があります。他の葉は、そのような組織のためのサイトカインまたは組織のホモジネートと同じマウス内の他の実験の質問のために使用することができます。

5。代表的な結果：

後発開発途上国（LDCs）や肺の肺胞マクロファージは、肺の肺胞腔から抗原を取得、すぐに注射した後。図3は、CD11cは+（後発開発途上国（LDCs）や肺胞マクロファージに発現する）の割合蛍光標識炭疽菌の芽胞陽性の細胞は、30分後に注入を示しています。この時点では、肺の単一細胞の懸濁液中のCD45 + CD11c +細胞の〜15.9％ 炭疽菌の胞子（図3、下側のパネル）をかくまった。肺のCD11c +細胞のさらなる特徴付けのために、金とBraciale ⁴を参照してください。蛍光標識ビーズを日常的にLDLNs ⁹に粒子状抗原の人身売買を評価するために使用されます。 LDLNsに肺からこの輸送を評価するために、蛍光ラテックスビーズは、LPSとLDLNsでそれを注入した24 HPIで分析した。 LDLNsのCD11c ^ハイテク細胞^の約4％が24hpi（図4）で蛍光ビーズをかくまった。これらの代表的な実験は、このプロトコルは効率的にLDLNsへのトラフィック、それらを後に肺に吸入粒子状抗原を獲得し、細胞を追跡するために使用できることを示している。

図1。木製のそれ注入中にマウスを抑制するためのプラットフォーム。木製のブロックが斜めにカットし、金属の棒は、正面図1a適合させたれた）と側面図を図1b）。ワイヤーの小片は、マウスの前部歯を固定する金属の棒に巻き付けていた。リボンの部分は、手順の間の場所を保存しておいてマウスの周りに結びつけるためのプラットフォームに装着された。

図2。その注射のための強制飼養針。強制飼養針は（右）に注射用〜135 °（左）の角度で曲がっていた。

図3。 炭疽菌の発現に注入されたGFP（スターン- p6GFP）、5時間後の課題を抱いて肺内のすべてのCD11c +細胞の割合 。 AJマウスは1xでの挑戦であった10 ⁸ GFP -炭疽菌の胞子と肺は5時間後の感染で分析した。ドットプロットでは、 炭疽菌の陽性なのCD11c +肺細胞の割合を示しています。

図4。私は以下のリンパ節の24時間排水肺の蛍光ビーズの検出（緑/黄）。トン注入。 AJマウスは、それとLDLNsが24hpi分析した10μgのLPS（右パネル）を含むPBS（左パネル）または5 × 10 ⁹ Fluoresbrite YGミクロスフェア（0.5μmの）のどちらかを与えられた。代表的なドットプロットでは、空のチャネルに対してプロットした蛍光ビーズを抱いLDLNsのCD11c ^{ハイテクの}細胞の割合を示しています。

我々は、肺からLDLNsに炭疽菌の胞子の人身売買を研究するためにこのプロトコルを利用してきた。同様のアプリケーションの場合は、肺に送達粒子の数を慎重に注入材をフローサイトメトリーによってLDLNsで検出することができるように選択する必要があります。我々はまた、正常細胞と蛍光標識抗体を使用して、特定の肺の細胞集団のラベリングの養子移入のためにこのメソッドを使用している。さらに、この方法は日常的に直接肺に¹⁰にブレオマイシン（肺線維症の化学誘導物質）やサイトカインを管理するために使用されます。

このメソッドは肺に試験物質の一貫性のある配信を可能にするが、それは広範囲な訓練と検証を（肺の中に染料を浸透させることによって達成）が必要です。それが重要な相互作用と免疫応答が開始されることがあります上気道を除外するため、このメソッドは、吸入の他のルートと同じ生理的関連性を持っていない可能性があります。しかし、それは解釈が頭頸部の局所リンパ節で、気道上皮の刺激による投与剤の摂取により、複雑にすることができる場所が望ましい。実験を設計する際はすべてのモデルと同様に、そのような投与量、配信のための車両、注入材料、呼吸上皮と麻酔の効果への損傷の分布などの実験的な要因がすべて考慮されるべきである。その点滴のための従来の手順と比較すると、我々は、このメソッドは大幅に気道上皮の損傷を減少させると信じています。接種部位での損傷は、リンパ節^〜11抗原の配信に影響を与える可能性があるので、それにもかかわらず、適切な対照群が損傷を考慮するために使用する必要があります。我々は、車両としての生理食塩水を使用することをお勧めしますが、テストの材料は有効性のための特定のメディアを必要とする場合、車両のコントロールは無視されるべきではない。肺の別の葉に注入された粒子状物質の分布は、特定の実験のための重要なパラメータがあります。すぐに注射後このような場合には、葉のそれぞれが別々に分析することができます。それを点滴のルートを以下の肺の別の葉への物質の分布は、コスタリカら¹²で記載されている。

我々は最も野生型でアクセス可能な上記のリンパ節に分析を集中し、私たちのラボで使用されるマウスの系統をノックアウト。しかし、また、分析されることがあります胸部^13,14の追加のリンパ節があります。より多くのリンパ節は実験のための望ましい場合には、我々は、プロトコルで説明されているように蛍光ビーズのip注射を使用して初期の識別をすることをお勧めします。我々は分析のために推奨されているリンパ節の二つは、したがって、抽出時に注意すべきである胸腺に近接している。

前述のように、このメソッドは感染性微生物、アレルゲンや毒素の様々な肺を公開するために適応させることができます。それは、吸入暴露の従来のルートにシンプルで一貫性のある代替手段を提供し、上気道を除きます。そのほかのサイトの前に肺と肺所属リンパ節に開始するイベントに焦点を当てた実験のために特に便利です。