The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This article is a part of JoVE Bioengineering. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 54.224.79.93, User IP: 54.224.79.93, User IP Hex: 920670045
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
Unable to load video. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
An unexpected error occurred. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
Optisk mikroskopi, som ger värdefulla insikter på cellulär och organell nivåer, har varit allmänt erkänd som en möjliggörande biomedicinsk teknik. Som stöttepelarna för in vivo tredimensionell (3-D) optisk mikroskopi, single-/multi-photon fluorescensmikroskopi och optisk koherens tomografi (OCT) har visat att de extra känsliga för fluorescens och optiska spridning kontraster, respektive. Har dock optisk absorption kontrast biologiska vävnader, som kodar grundläggande fysiologiska / patologiska information, ännu inte bedömas.
Framväxten av biomedicinska photoacoustics har lett till en ny gren av optisk mikroskopi optisk upplösning photoacoustic mikroskopi (OR-PAM) 1, där den optiska strålning är fokuserad på diffraktionsgränsen att uppnå cellulär 1 eller till och med subcellulära 2 nivå lateral upplösning. Som ett värdefullt komplement till befintlig optisk mikroskopi teknik, ger OR-PAM i minst två nyheter. Först och viktigast av allt, upptäcker OR-PAM optisk absorption i kontrast till extraordinära känslighet (dvs 100%). Kombinera eller-PAM med fluorescensmikroskopi 3 eller med optiska-spridning-baserade 4 oktober (eller båda) ger omfattande optiska egenskaper hos biologiska vävnader. För det andra, kodar OR-PAM optisk absorption i akustiska vågor, i motsats till den rena optiska processer i fluorescensmikroskopi och oktober, och ger bakgrundsinformation utan upptäckt. Den akustiska upptäckt i ELLER-PAM dämpar effekterna av optiska spridning på signal nedbrytning och naturligt eliminerar eventuell interferens (dvs crosstalks) mellan excitation och detektion, vilket är ett vanligt problem i fluorescensmikroskopi på grund av överlappning mellan excitation och fluorescens spektra.
Unikt för optisk absorption avbildning har OR-PAM visat bred biomedicinska tillämpningar sedan uppfinningen, inklusive men inte begränsat till, neurologi 5, 6, oftalmologi 7, 8, vaskulärbiologi 9, och dermatologi 10. I den här videon lär vi systemkonfiguration och anpassning av OR-PAM samt experimentella förfaranden för in vivo funktionell mikrovaskulära avbildning.
Optisk strålning källa: en diod-pumpad solid-state pulsad laser (INNOSLAB, Edgewave) och en färgämneslaser (CBR-D, Sirah).
Utgången Laserstrålen (pulsbredd: 7 ns) är fokuserad genom en kondensor lins (LA1131, Thorlabs) att passera genom ett 50-ìm hål (P50C, Thorlabs).
Den Pinhole är placerad en aning bort från fokus på kondensorn objektivet för att matcha hål diameter med grundläggande-mode balk diameter för effektiv fysisk filtrering.
Den filtrerade strålen dämpas av en neutral density filter (NDC-50C-2M, Thorlabs) och sedan kopplat in ett single-mode optisk fiber (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
Fibern utgång fyller baksidan öppning av ett mikroskop mål (RMS4X, Thorlabs) för att uppnå en diffraktion begränsad optisk fokus ~ 2,6 ìm vid våglängden 570 nm.
Ultraljudet givare är ansluten till en hemmagjord akustisk optisk stråle combiner 11 för ultraljud upptäckt, vilket är i linje koaxialt med diffraktion-begränsad optisk strålning.
En sfärisk kavitet slipas ut från botten av combiner att producera en akustisk lins. Denna akustiska lins har en numerisk bländare på 0,5 i vatten och ger en akustisk fokus diameter på 43 ìm på 50-MHz mittfrekvens.
Den optiska och akustiska fokus är i linje confocally att maximera känslighet.
Akustisk koppling
Torr ultraljud koppling är anställd för att undvika att sänka ned försöksdjur i vatten, som användes i början photoacoustic bildsystem 12.
En avbildning öppnas i botten av en petriskål (9 cm i diameter) och är förseglad med ett ultraljud och optiskt transparent polyeten membran.
Ultraljud gel (Rensa Image, SonoTech) mellan polyeten membranet och det föremål som skall avbildas par den genererade photoacoustic våg från objektet till petriskål och avjoniserat vatten i petriskålen ytterligare par vågen till våt-eller-PAM imaging huvudet .
Elektronik
Den photoacoustic signalen detekteras av ultraljud givaren förstärks av två överlappande förstärkare (ZFL 500LN, Mini-Circuits)
Den förstärkta signalen digitaliseras med en 14-bitars datainsamling (DAQ) styrelse (CompuScope 14200 och Gage yrkeshögskola) med en samplingshastighet på 200 MS / s.
Scanning system
Tvådimensionella (2-D) raster scanning av OR-PAM avbildning huvudet längs den vågräta (xy) planet styrs av en persondator, som utlöser både DAQ styrelsen och pumpen laser. Den utlösande signalen är synkroniserad med klockan ut signalen från DAQ styrelsen.
Den snabba axel 2-D scanner definieras som riktningen på tvärsnitts-scan (B-scan).
En sekvens av B-scan bilder kan förvärvas genom att översätta avbildning huvudet längs den långsamma axeln för att bilda en volymetrisk bild som kan visas antingen i en direkt 3-D rendering eller i en 2-D maximal amplitud projektion (MAP) bild .
2. System anpassning
Använd puls-eko ultraljud och ett ultraljud reflektor för att bestämma läget för den akustiska fokalplanet (dvs tidsfördröjningen från trigger signal till den maximala puls-eko ultraljud signal). Detta steg krävs endast utföras en gång när man bygger OR-PAM-system.
Maximera kopplingen effektiviteten i single-mode fiber.
Applicera ultraljud gel på toppen av ett optiskt absorberande objekt (t.ex. en bit svart tejp) och försiktigt fast den under avbildning fönstret i petriskål fylld med avjoniserat vatten.
Sänk bildhantering huvudet i vattnet och ta bort luftbubblor fångade under Acoustic Lens.
Justera avbildning huvudet tills photoacoustic signal absorbera objektet från den akustiska fokalplanet, som kan bedömas från den akustiska dröjsmål.
Justera vertikal position (dvs Z-position) i mikroskop mål att maximera amplituden på photoacoustic signalen genereras från det platta objektet. Största möjliga signal amplitud tyder på att den optiska fokus är i linje med den akustiska fokus i vertikal riktning.
Justera den horisontella positioner (dvs x-och y-positioner) av mikroskopet målet tills photoacoustic signalen genereras från målet visar ett symmetriskt mönster. Symmetrin tyder på att den optiska fokus är i linje med den akustiska fokus i horisontell riktning.
Upprepa steg 2,6 och 2,7 tills photoacoustic signalen är optimerad både symmetri och amplitud.
3. En SA mple experimentell procedur-in vivo-eller-PAM av mus öra kärlsystemet
Det här steget krävs inte för nakna möss. Bedöva djur med en intraperitoneal injektion av en cocktail [recept: 1 ml ketamin (100 mg / ml), 0,1 ml xylazin (100 mg / ml) och 8,9 ml koksaltlösning, dosering: 0,1 ml/10 g]. Raka håret i örat, och ytterligare Vaxning varar kvarvarande håret med surgi Cream (Kategori #: 82.565, American International Industries) innan du rengör den med avjoniserat vatten. Observera att en sådan hårborttagning något kan irritera huden kärlsystemet och därmed är bäst utförs 24 timmar före den planerade experiment.
Slå på photoacoustic laser systemet, och kontrollera systemet anpassningen.
Bedöva musen med 3% isofluran förångas av inandning av gas (den typiska flöde är 1,0-1,5 l / min, beroende på djurets kroppsvikt), och underhålla anestesi med 1% isofluran under hela försöksperioden. Medicinsk kvalitet luft rekommenderas som inandning av gas för att hålla musen på normala fysiologiska status.
Överför musen till en stereotaktisk scen och kontrollera sin kroppstemperatur vid 37 ° C med en värmedyna.
Platta musen örat på en plastplatta och applicera ett lager av ultraljud gel ovanpå örat. Undvik att droppa luftbubblor inne i gelen. Sedan placera örat under avbildning fönstret och sakta höjer djuret scenen tills de kontakter ultraljudsgel botten av polyeten membranet. Mjuka kontaktlinser krävs eftersom att trycka örat mot membranet kan påverka blodflödet i örat.
Kläm en pulsoximeter till musen benet eller svansen för att övervaka dess fysiologiska status, och tillämpa salva till ögonen för att förhindra torrhet och oavsiktliga laser skador på musen ögonen.
Sänk avbildning huvudet tills den akustiska linsen är nedsänkt i avjoniserat vatten och ta bort luftbubblor fångade under Acoustic Lens.
Kontrollera lasern fluensen att se till att det ligger inom de standarder lasersäkerhet av American National Standards Institute 13. Lasern fluensen bör inte överstiga 20 mJ / cm 2, vilket innebär 80 nj hos laserpuls energi när laserstrålen är fokuserad på 150 ìm under hudytan.
Ställ lasern till den externa-trigger-läge och börjar rättegången skanning. Justera z position avbildning huvudet tills den starkaste photoacoustic signalen från den akustiska fokalplanet.
Ställ in korrekt avsökningstäthet och börja formella bilden förvärvet.
Efter experimentet, stänga av laser, lyft avbildning huvudet ur avjoniserat vatten, sänk djuret skede att släppa musen, rengöra musen örat med avjoniserat vatten, stänga av anestesi-systemet och temperaturen controller, och lossa musen från stereotaktiska scenen.
Om repetitiva avbildning krävs, placera musen i en inkubator med den omgivande temperaturen inställd på 37 ° C. Återgå musen för att djuret anläggningen när den vaknar naturligt. Annars följer djuret protokoll euthanatize och avyttra den.
4. Funktionell eller-PAM av total koncentration och syremättnad i hemoglobin
Oxyhemoglobin (HBO 2) och deoxyhemoglobin (HBR) är de två viktigaste formerna av hemoglobin, den dominerande endogena photoacoustic källa i det synliga spektralområdet. HBO 2 och HBR har tydliga optiska absorptionsspektra och därmed kan spektralt differentieras att kvantifiera såväl den totala koncentrationen (HBT) och syremättnad (SO 2) av hemoglobin 5. Här är två riktlinjer för att hjälpa till att välja rätt optiska våglängder för SO 2 mätningar:
Våglängder bör väljas inom Q-bandet av hemoglobin absorptionsspektrum (dvs 550-600 nm) för att säkerställa en tillräcklig signal-brus-förhållande och tillräcklig penetration.
Våglängder där absorptionskoefficient HBO 2 och HBR har en uttalad skillnad (t.ex. HBR-dominanta 561 nm och HBO 2-dominanta 578 nm) rekommenderas.
Förutom SO 2 kan HBT beräknas genom att addera [HBR] och [HBO 2] tillsammans, eller det kan mätas direkt vid isosbestic våglängder av molar extinktionskoefficienten spektra av hemoglobin (t ex 530 nm, 545 nm, 570 nm, och 584 nm) 14, där HBR och HBO 2 har lika molar extinktionskoefficienterna.
5. Representativa resultat:
Visas i figur 1 är den vaskulära anatomin och SO 2 i en levande naken mus öra avbildas med dubbla våglängder (561 och 570 nm) eller-PAM. Den typiska bilden Förvärvet dags för dubbla våglängder SO 2 mätningar av en sådan region av intresse (bildstorlek: 10 mm x 10 mm, steglängd: 2,5 ìm x 5 mikrometer) är ~ 80 min.
p_upload/2729/2729fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/> Figur 1.In vivo optisk upplösning photoacoustic mikroskopi. Kartbilder av (a) Den totala hemoglobinkoncentration visar den vaskulära anatomin (förvärvat vid 570 nm) och (B) hemoglobinvärdet syremättnad (förvärvat vid 561 nm och 570 nm) på en naken mus öra. (C) Närbild på den inramade region i panelen (A). Skalan bar i panelen (A) gäller för båda (A) och (B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
I den här videon ger vi en detaljerad instruktion på FÖRSÖKSPROTOKOLL för OR-PAM, inklusive systemkonfiguration, systemet justering och typiska experimentella procedurer. Etikett-fri, icke-invasiv OR-PAM har möjliggjort studier av mikrovaskulära fungerar och ämnesomsättningen på en enda kapillär grund och därmed har potential att utöka vår förståelse av mikrocirkulationen-relaterade fysiologi och patologi. Microphotoacoustics närvarande tillverkar denna eller-PAM-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Alla försöksdjur förfaranden har utförts i överensstämmelse med försöksdjur protokollet godkänts av School of Medicine Animal Studies kommitté Washington University i St Louis.
Författarna uppskattar Dr Lynnea Brumbaugh är närläsning av manuskriptet. Detta arbete sponsrades av National Institutes of Health bidrag R01 EB000712, R01 EB008085, R01 CA134539, U54 CA136398 och 5P60 DK02057933. Prof. Lihong V. Wang har ett ekonomiskt intresse i Microphotoacoustics, Inc. och Endra, Inc., som dock inte stödja detta arbete.
Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., and Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt. Lett. 33(9), 929-931 (2008).
Zhang, C., Maslov, K. and Wang, L. V. Subwavelength-resolution label-free photoacoustic microscopy of optical absorption in vivo, Opt. Lett. 35(19), 3195-3197 (2010).
Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., and Wang, L. V. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE. Trans. Biomed. Eng. 57(10), 2576-2578 (2010).
Jiao, S., Xie, Z., Zhang, H. F., and Puliafito, C. A. Simultaneous multimodal imaging with integrated photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Opt. Lett. 34(19), 2961-2963 (2009).
Hu, S., Maslov, K., Tsytsarev, V., and Wang, L. V. Functional transcranial brain imaging by optical-resolution photoacoustic microscopy. J. Biomed. Opt. 14(4), 040503 (2009).
Hu, S., Yan, P., Maslov, K., Lee, J.M., and Wang, L. V. Intravital imaging of amyloid plaques in a transgenic mouse model using optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt. Lett. 34(24), 3899-3901 (2009).
Hu, S., Rao, B., Maslov, K., and Wang, L. V. Label-free Photoacoustic Ophthalmic Angiography. Opt. Lett. 35(1), 1-3 (2010).
Jiao, S. L., Jiang, M. S., Hu, J. M., Fawzi, A., Zhou, Q. F., Shung, K. K., Puliafito, C. A., and Zhang, H. F. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt. Express 18(4), 3967-3972 (2010).
Oladipupo, S., Hu, S., Santeford, A., Yao, J., Kovalski, J. R., Shohet, R., Maslov, K., Wang, L. V., and Arbeit, J. M. Conditional HIF-1 induction produces multistage neovascularization with stage-specific sensitivity to VEGFR inhibitors and myeloid cell independence. Blood (in press).
Hu, S., Maslov, K., and Wang, L. V. In vivo functional chronic imaging of a small animal model using optical-resolution photoacoustic microscopy. Med. Phys. 36(6), 2320-2323 (2009).
Hu, S., Maslov, K., and Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt. Lett. 36(7), 1134-1136 (2011).
Wang, X., Pang, Y., Ku, G., Xie, X., Stoica, G., and Wang, L. V. Noninvasive laser-induced photoacoustic tomography for structural and functional in vivo imaging of the brain," Nat. Biotechnol. 21(7), 803-806 (2003).
Laser Institute of America, American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136.1-2007. American National Standards Institute Inc., New York, NY (2007).
Jacques, S. L., and Prahl, S. A. http://omlc.ogi.edu/spectra/hemoglobin/index.html.
Nice topic.I feel better to understand that the acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. http://www.anuprashbd.com
1
ReplyPosted by: Rafiqul HossainNovember 13, 2011, 2:15 AM