La medición de la cohesión agregado por tensiometría tejido de la superficie

1. La preparación de agregados para la medición de la tensión de los tejidos de la superficie.

Para células adherentes, esferoides se pueden formar utilizando el método de colgar gota o mediante la generación de una hoja coherente de las células que luego se puede cortar en fragmentos de 1 mm.

La formación de agregados por el método de gota:

1. Casi confluente culturas de células adherentes deben ser cultivadas a 90% de confluencia, las monocapas con lo cual se deben enjuagar dos veces con PBS. Después de drenar bien, añadir 2 ml (para placas de 100 mm) de la tripsina-1 0.05% mM EDTA y se incuba a 37 ° C hasta que las células separar. Dejar de tripsinización mediante la adición de 2 ml de medio completo y con cuidado el uso de una pipeta de 5 ml para triturar la mezcla hasta que las células están en suspensión. La transferencia de células a un tubo cónico de 15 ml.
2. Añadir 40 ml de un 10 mg / ml de solución de DNAsa e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Vortex brevemente y centrifugar a 200 xg durante 5 minutos.
3. Desechar el sobrenadante y lavar pellet con 1 ml de medio completo de cultivo de tejidos. Repito, pues suspender las células en 2 ml de medio completo de cultivo de tejidos.
4. Contar las células con un hemocitómetro, o contador celular automático y ajustar la concentración de 2,5 x 10 ⁶ células / ml.
5. Quite la tapa de un plato de cultivo de tejidos de 60 mm y colocar 5 ml de PBS en el fondo del plato. Esto actúa como una cámara de hidratación.
6. Invertir la tapa y el uso de una pipeta de 20 l de depósito l 10 gotas en la parte inferior de la tapa. Asegúrese de que las gotas se colocan lo suficientemente separados para que no toque. Es posible colocar al menos 20 gotas por plato.
7. Invertir la tapa sobre el PBS cámara llena de fondo y se incuba a 37 ° C / 5% CO ₂ / 95% de humedad, controlar las gotas todos los días y se incuban hasta que las hojas de células o grupos, se han formado.
8. Una vez que forman las hojas, que pueden ser transferidos a fondo redondo coctelera frascos que contienen 3 ml de medio completo y se incubaron en un baño de agua agitando a 37 º C y 5% de CO ₂ hasta que se formen esferoides.

La formación de agregados por el método de capa celular:

9. Suspensiones de células individuales se preparan como se describe más arriba, pero la concentración se ajusta a 1x10 ⁶ células / ml.
10. La transferencia de 3 ml de la suspensión celular a 10 ml matraces de fondo redondo (Belco, Vineland, NJ).
11. Incubar los frascos en un baño de agua giratorio / agitador (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 4 horas a 120 rpm hasta que las células a recuperarse de tripsina.
12. La transferencia de células a un tubo de vidrio de centrífuga de fondo redondo y se centrifuga a 200 g X en una fina pastilla. Incubar por otras 24 horas hasta que se forme la hoja coherente.
13. Agite suavemente el tubo de cultivo para sacar la hoja y vierta el contenido del tubo de la cultura en un plato pequeño, la cultura de vidrio estériles para tejidos.
14. Use bisturíes micro para cortar las hojas en fragmentos de diferentes tamaños.
15. Incubar fragmentos a 37 ° C en el agitador giratorio al baño maría a 120 rpm menos del 5% de CO ₂ por 2 ó 3 días o hasta que se convierten esférica.

2. Medición de la tensión de la superficie total

1. El tensiómetro de superficie del tejido. El aparato se muestra en las figuras. 1 y 2. La celda de compresión (Fig. 3) se compone de dos cámaras. La cámara exterior (CO) está conectado a una bomba de agua de 37 ° C en circulación, y sirve para regular la temperatura de la cámara interna (IC). Las cámaras están construidas con Delrin molido y contener ventanas de cuarzo para la visualización de los áridos. El menor de montaje (LA) tornillos en la base de la cámara interior y se utiliza para: 1) la posición del conjunto en la cámara interior, 2) el sello de la parte inferior de la cámara interior, 3) elevar la suma para iniciar la compresión, y (4 ) el control de la distancia entre las placas paralelas y por lo tanto, la compresión de los agregados. El núcleo central (CC) de la asamblea es ajustable. La punta del núcleo central (el pedestal) se compone de suaves de teflón y actúa como la placa de compresión más baja (LCP). La placa de compresión superior (UCP) es un cilindro de teflón de 15 mm de largo que cuelga del brazo de equilibrio (B) por una llama-se enderezó de alambre de níquel-cromo (NCW) *. Durante el curso de un experimento, el agregado de células (A) se coloca en la placa inferior y se crió hasta que haga contacto con la placa superior. La placa superior está conectado al brazo de equilibrio (B). La compresión de los agregados provocan un desplazamiento del brazo de equilibrio. El equilibrio es un Cahn / Ventron modelo 2000 electrobalanza grabación, que opera en el principio de equilibrio nulo. El punto de apoyo del brazo de la balanza tiene una armadura dentro de un campo magnético permanente. Cuando el equilibrio está en marcha, continuamente modula la corriente que pasa a través de la asamblea electromagnéticas, que a su vez mantiene el brazo de la balanza en posición horizontal. Cuando un objeto está suspendido del brazo de la balanza, la tensión, que el equilibrio se aplica para mantener el brazo en el horizoposición ntal, es proporcional al peso del objeto. Esta tensión se mide la fuerza externa aplicada a la compresión del agregado. La forma del conjunto es monitoreado por la observación visual a través de un estereoscopio de 25 x Nikon SMZ10A acoplado a un ordenador equipado con una tarjeta capturadora. A fin de minimizar la adherencia de los agregados de células a las placas de compresión, tanto en las placas de compresión inferior y superior fueron recubiertas con poli (2-hidroxietilo) {poli (HEMA)}, un material polimérico para que las células no se adhieren ^16.
   * El cable se llama-se enderezó en la horca, una longitud de 15 pulgadas de alambre de un soporte vertical y un clip de sujeción cuaderno pequeño hasta el final. Un mechero de Bunsen es entonces correr arriba y abajo de la longitud del cable hasta que el cable se ilumina en rojo. El alambre enderezado puede ser cortada en la longitud apropiada. Un pequeño gancho se forma doblando el alambre alrededor de ¼ de pulgada de la final con dos hojas de afeitar. El otro extremo se inserta en el cilindro de la placa de compresión más baja.
2. La compresión global.
   1. La cámara interior está llena de pre-calentado CO _{2-independiente} medio de cultivo de tejidos (Gibco / BRL, NY).
   2. Los agregados varían en tamaño de alrededor de 200-300 μ se colocan en la placa de compresión más baja (Fig. 4A). Los agregados son cargados por aspiración de un agregado en el medio de cultivo de tejidos a mitad de camino hasta la punta de una pipeta Pasteur provista de una bombilla de silicona, la transferencia de la pipeta a la cámara interior, y el posicionamiento de la punta de la pipeta por encima de la LCP. El agregado entonces expulsarlo lentamente en el LCP apretando suavemente el bulbo. Por otra parte, el conjunto se deja caer por gravedad en la LCP.
   3. La placa de compresión superior (UCP) se coloca por encima de la suma y se deja reposar, el establecimiento de un pre-compresión de referencia aparente peso UCP.
   4. El LCP se eleva entonces hasta que la suma se comprime contra la UCP (Fig. 4B). Ajuste de la altura del núcleo interno del aparato de control inferiores a los diferentes grados de compresión. La compresión se controla mediante la observación a través de un microscopio de disección equipado con una cámara de vídeo CCD.
   5. Imágenes agregadas son capturados, digitalizados y analizados mediante el ImageJ. Cambio aparente de peso UCP se registra continuamente en un registrador de banda, el logro del equilibrio forma se designa con el estancamiento de la tensión de salida de la balanza Cahn. Cada conjunto se somete a dos diferentes grados de compresión.
3. Cálculo de la tensión de la superficie total.
   En equilibrio, la forma, la cohesividad de un agregado de células comprimido entre dos placas paralelas a las que no se adhiere se puede obtener de la ecuación de Young-Laplace (Fig. 5), donde σ es cohesividad, F es la fuerza que actúa para comprimir el agregado , πr ₃ ² es el área de la superficie de los áridos en la que se ejerce la fuerza F, _y R2 _y R3 son, respectivamente, el radio del ecuador de la suma comprimido y el radio de un arco de la definición de su perfil normal de la superficie a la compresión de las placas y se extiende entre ellos (Fig. 6). La medición de la fuerza de compresión y de la geometría en la fuerza y ​​el equilibrio y la forma de aplicar estas medidas a la ecuación de Young-Laplace genera valores numéricos de tensión aparente superficie del tejido. Al alcanzar el equilibrio y el cálculo de σ _1, los agregados se descomprimen y se les permite acercarse a un equilibrio de segundo y σ ₂ se calcula como se describe anteriormente.
4. La confirmación de la liquidez global.
   La tensión de la superficie calculada de un total de líquido, cuando se somete a dos compresiones diferentes se mantendrá constante. En tales agregados la relación entre σ ₂ / σ ₁ será igual a 1 y será menor que la proporción de la fuerza aplicada en cada compresión sucesivas (F ₂ / F _1). Por el contrario, la tensión superficial de un agregado calculado elástica obedece la ley de Hooke y aumentan de forma proporcional a la fuerza aplicada. Para los agregados de la relación de elasticidad de σ ₂ / σ ₁ no será igual a 1, sino que se acercará a la relación de F ₂ / F _1. La tensión superficial de los agregados de líquido también será independiente del tamaño total de ^2,17. Mediciones único en el que la tensión superficial es independiente de la fuerza aplicada y el tamaño se utilizan para calcular σ promedio para cada línea celular.

3. Los resultados representativos:

A continuación se muestra una tabla de resultados TST típica de los agregados de los fibroblastos de próstata de la rata (FPR) y la rata células del músculo liso de próstata (RPSMC). Como se puede observar en la figura. 7 agregados de células del FPR tienen una tensión superficial de 22,8 ± 1,1 dinas / cm. Por otra parte, los valores promedio de la superficie la tensión medida después de la compresión y un después de la compresión 2 fueron estadísticamente identiCal, en comparación con una prueba t pareada. También se compararon las proporciones de σ ₂ / σ ₁ y F ₂ / F ₁ para garantizar que estos agregados no obedecer la ley de Hooke, como lo harían si se comportaban como sólidos elásticos. Como se demuestra en la Tabla 1, la relación entre σ ₂ / σ ₁ no llegáis a 1,0. Por otra parte, la proporción de F ₂ / F ₁ fue significativamente mayor que σ ₂ / σ ₁ (prueba t pareada, p <0,05), que confirma que estos agregados no obedecen la ley de Hooke y, de hecho, se comportan como líquidos. En contraste RPSMCs obedecido la ley de Hooke. Como es evidente en la Tabla 1, la proporción de σ ₂ / σ ₁ es significativamente mayor que 1 y no fue estadísticamente diferente a la de F ₂ / F _1. Para demostrar aún más líquidos-como el comportamiento, se exploró la relación entre la tensión superficial (σ) y al volumen total. Como se puede observar en la figura. 8, el volumen es independiente de la sigma para las células del FPR (línea de regresión de color rojo, r ² = 0,002), mientras que parece que hay cierta dependencia de la sigma en el volumen de RPSMCs (línea de regresión azul, r ² = 0,146). Estos datos confirman que los agregados del FPR se comportan de una manera semi-líquido, mientras que las de RPSMCs parecen comportarse más como sólidos elásticos. Sólo aquellos mesurements obtenidos a partir de los agregados se comportan como líquidos se utilizan para calcular la tensión superficial.

Figura 1. Descripción del tensiómetro superficie del tejido.

Figura 2. Una visión más detallada de la cámara de tensiómetro (panel derecho).

Figura 3. Representación esquemática de la cámara del tensiómetro.

Figura 4. Imágenes de vídeo de alta (A) y se comprime (B) agregados.

Figura 5. La ecuación de Laplace.

Figura 6. Esquema de una gota de líquido comprimido entre dos placas paralelas a las que se adhiere mal, en el equilibrio de forma. R ₁ y R ₂ son los dos radios de curvatura primaria, en el ecuador de la gota y en un plano a través de su eje de simetría, respectivamente. _R3 es el radio del área circular de la gota de contacto con placa de compresión sea. H es la distancia entre las placas de compresión superior e inferior. X es uno de los lados de un triángulo rectángulo con hipotenusa R ₂ se extiende hasta un punto de contacto entre la superficie de la gota y, o bien la placa de compresión.

Figura 7. TST mediciones y la confirmación de liquidez agregada para los agregados de los fibroblastos de próstata de la rata y células musculares lisas.

Figura 8. Relación entre el sigma y el volumen de los agregados del FPR (línea roja) y RPSMCs (línea azul).

Medir la cohesión global de la prueba resulta relativamente sencillo. Hay, sin embargo, los pasos clave que hay que dominar con el fin de generar información útil TST; 1) Los agregados deben ser "saludables". Esto puede ser controlado por asegurar que la formación de agregados se inicia con las células que están en la confluencia óptima antes de la separación. Tamaño de los agregados y el tiempo en la cultura también debe ser controlada para minimizar el desarrollo de un núcleo necrótico en el agregado, 2) Otro parámetro que puede influir en las mediciones TST es el grado de adhesión de la suma de las placas de compresión superior o inferior. En consecuencia, la concentración óptima de poli-HEMA se utiliza para recubrir las placas debe ser determinada empíricamente para cada tipo de agregado, 3) Aunque es preferible que antes de la compresión de los agregados debe ser lo más esférica posible, no es estrictamente necesario. Algunos agregados, especialmente los que se mantienen unidos débilmente, no tienden a formar esferas perfectas. La explicación de esto es que con el fin de células completamente redonda-up debe gastar energía por el movimiento y volver a arreglar. Si la cantidad de energía necesaria para redada en una esfera superior a la minimización de la energía de ser esférica, los agregados tienden a puesto en alguna forma sub-esférica. En nuestra experiencia, tales agregados al convertirse en comprimidos, resistir la fuerza de compresión en una medida que los lados de la forma agregada semi-círculos, exactamente como lo harían si a partir de una esfera perfecta, 4) También es importante que las placas de compresión son paralelas a una otra. Esto se logra mejor al asegurar que el cable de níquel-cromo es recto y que el instrumento se encuentre nivelada. Si estas medidas se cumplan, tensiometría tejido de la superficie es relativamente simple y puede generar información muy útil sobre las propiedades mecánicas de los tejidos y de sus determinantes moleculares subyacentes.

Otros métodos para medir la cohesión global existen, algunos que eliminan la necesidad de equipo especializado como el electrobalanza Cahn. Uno de estos métodos aspirados un esferoide en una pipeta de diámetro mucho menor que la del esferoide, con una presión de succión constante. Las propiedades viscoelásticas del tejido se deducen de la variación de la cepa mediante la medición del cambio en la longitud del material celular a medida que fluye dentro de la pipeta de ^{18 años.} Si bien es útil, este método puede tener limitaciones en cuanto a la gama de tensiones superficiales en las que se pueden aplicar. Agregados muy débil sería probablemente destruido cuando se aspiran en la pipeta, mientras que los agregados que se mantienen unidos muy fuertemente que no se puede aspirar a todo. Placa de compresión paralela se ha medido la tensión superficial tan bajo como 0,33 ± 0,02 dinas / cm para ectodermo pez cebra capa germinal tratados con E-cadherina morfolino ³ hasta un máximo de 20,1 ± 0,5 dinas / cm para los agregados de embriones de pollo miembro mesodermo ² yemas, lo que demuestra su de uso general en una amplia gama de cohesión para varios sistemas embrionarias.