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 JoVE Immunology and Infection

“发光法”的分类检测细菌病原体的记者噬菌体

1, 2, 3

1BioSciences Division, Guild Associates, Inc., 2Department of Molecular Genetics and Microbiology, University of Texas at Austin, 3Department of Craniofacial Biology, Medical University of South Carolina

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Cite this Article: “发光法”的分类检测细菌病原体的记者噬菌体

Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. 'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (53), e2740, doi:10.3791/2740 (2011).

Abstract: “发光法”的分类检测细菌病原体的记者噬菌体

鼠疫耶尔森氏菌和炭疽芽孢杆菌 ，鼠疫，炭疽病原体，分别为1 A类的细菌病原体。虽然这两种疾病的“自然的发生，是目前比较少见的，使用这些病原体作为一个生物武器的恐怖团体的可能性是真实的。由于固有的传染性疾病的，快速的临床过程，和死亡率高，关键是快速检测爆发。因此，提供快速检测和诊断的方法，是必须立即执行，以确保公众健康的措施，并启动危机管理。

重组记者噬菌体可能会提供一个快速检测Y 的具体做法鼠疫杆菌和B 。 炭疽。疾病控制和预防中心目前使用的古典噬菌体裂解试验证实这些2-4细菌病原体识别。这些检测利用自然产生的噬菌体，这是具体和裂解细菌主机优势。隔夜后在特定的噬菌体的存在耕地细菌生长，形成斑块（细菌裂解）提供了一个积极识别细菌的目标。虽然这些实验是强大的，他们遭受三个缺点：1）他们是实验室的基础; 2）他们需要从怀疑样品的细菌分离和种植，和3），他们采取24-36 h内完成。为了解决这些问题，基因工程重组“轻标签”记者噬菌体哈维氏弧菌luxAB基因融入Y 的基因组鼠疫杆菌和B 。 炭疽特定的噬菌体5-8。由此产生的luxAB记者噬菌体是能迅速检测其具体目标（在几分钟之内），并巧妙地赋予一个发光的受体细胞的表型。更重要的是，检测，获得与耕地的受体细胞或模拟感染的临床标本7。

出于演示的目的，我们在这里描述为已知Y。噬菌体介导的检测方法鼠疫隔离使用噬菌体诊断的疾病预防控制中心鼠疫噬菌体ΦA11226,7（图1）建造一个luxAB记者。一个细微的修改（例如改变生长温度和媒体），类似的方法，可用于检测B 的炭疽杆菌菌株使用的B.炭疽记者噬菌体Wβ：luxAB 8。该方法描述了一个biolumescent表型的噬菌体介导的转耕地 Y。 鼠疫随后使用微孔板光度计测量细胞。传统的噬菌体裂解试验这种方法的主要优点是易于使用，快速的结果，并且能够同时测试多个样本，在96孔微孔板格式。

图1
图1。检测原理图。噬菌体混合样品，噬菌体感染的细胞，luxAB表示，和细胞bioluminesces。样品的处理是没有必要的;噬菌体和细胞混合在一起，其后轻。

Protocol: “发光法”的分类检测细菌病原体的记者噬菌体

1。Y。鼠疫板接种

  1. 数Y。鼠疫 A1122（BeiResources＃NR15）股票文化上卢里亚Bertani（LB）琼脂（米勒）。使用无菌技术，并执行所有的Y 。在一个生物安全柜。Y.一类II型鼠疫操作鼠疫 A1122是一个生物安全等级（BSL）2排除选择代理应变。它缺乏75 KB对低钙反应（LCR）的毒力质粒和PGM位点的毒力所必需的。成长Y。鼠疫在28 ° C下48小时在一个静态的温度控制空气孵化器。 y 的增长速度鼠疫是一代人的时间为1.25小时9缓慢。

2。Y。鼠疫菌的液体介质接种

  1. 转让一个单一的Y。鼠疫殖民地到无菌的17 × 100毫米的文化，含有2 mL LB培养基中使用无菌的金属接种环管。选择一个殖民地，大小均匀，其他殖民地的指示，显然是从殖民地板的其余部分隔开。涡管简要和发展文化在28 ° C，在一个摇床（225转）约20 h。

3。Y。鼠疫杆菌的生长，记者噬菌体此外，发光检测

  1. 稀一夜之间Y。鼠疫到文化在50毫升猎鹰管的新鲜LB培养基（如500μL的细胞到9.5毫升培养基）1:20和增长在28 ° C的晃动（225转） 。成长，直到在600海里（600）一个0.2的光密度达到（约5小时） 。生长的细胞是积极可取的自检测能力的噬菌体转导一个发光的反应是相关的宿主菌的生存能力和健身。然而，检测系统已被证明是兼容，在各个阶段的生长周期7的干细胞。
  2. 产生发光反应准备2％的N -癸醛的解决方案所需的基板。 200μLN -癸醛9.8 mL LB培养基中混合。涡大力为第5号总理微孔板发光注射器2毫升2％的N -癸醛的解决方案。预先设定的光度计autoinject 67μL癸醛解决方案，每个微孔板，然后立即读的样品为10秒。
  3. 免除分为3个文化管1 ml的LB培养基分装。加入20μL记者噬菌体储备液（5 × 10 9斑形成单位的股票[PFU] /毫升），每管;噬菌体和媒体单独样品作为阴性对照。在Y 的情况下鼠疫杆菌的细胞，除了记者噬菌体不应该引起发光响应。
  4. 分送1毫升分装的Y。鼠疫文化（步骤3.1）到6文化管。加入20μL记者噬菌体股票的文化（测试文化）3。其余3文化作为仅一个“细胞”阴性对照组（背景autobioluminescence）。混合震荡简要文化，收获从每个样品200μL（为0阅读），并免除变成白色的96孔微孔板。其余文化孵育28 ° C用颤抖的（225转）。
  5. 使用微孔板发光生物发光相对光单位（RLU）测量时间为0的样本。
  6. 收获200μL，每个样品后10，20，30，40，50和60分钟后记者噬菌体此外，生物发光测量样品。如果Y。鼠疫杆菌的细胞存在，记者噬菌体特异的细胞，注入其DNA，并使用主机的转录和翻译的机械抄写和翻译的luxAB记者基因（图1）。
  7. 信号强度和信号响应时间，是成正比的细胞数量目前。在高浓度的细胞（10 5 -10 8 CFU /毫升），显着增加的控制相比，在RLU应该是显而易见的，20分钟内。细胞浓度较低，（10 2 -10 4 CFU /毫升），在RLU显着增加，应该是显而易见的40-60分钟内。
  8. 另外，为加快检测过程，而不需要为 Y 鼠疫杆菌的生长，从殖民地的一个新增长板可以混合使用（震荡），直接在一个1.5毫升的Eppendorf管200μL的LB肉汤窝藏记者噬菌体。免除成一个微孔板以及细胞/噬菌体混合。在28 ° C孵育微孔板和阅读后60分钟（仅适用于单一的时间点）的生物发光的样本。

4。代表性的成果：

记者噬菌体代表时间课程实验介导检测 Y的图2描述了鼠疫杆菌 。 1阴性对照）噬菌体单（无细胞），或2）细胞（无噬菌体）整个60分钟公司提供约20 RLU生物发光的基线水平ubation（基线水平光度计具体）。相比之下，增加测试样本（记者噬菌体和细胞）的生物发光是明显的，在15分钟后，噬菌体此外。信号强度应该稳步增长超过60分钟。孵化延长时段（80分钟以上），将导致一个信号，即会下降，从峰值信号，由于噬菌体的宿主细胞介导的​​裂解。在孵化温度为37 ° C，即使获得了类似的结果为 Y的最佳温度鼠疫杆菌的增长是29 ° C 9。

图2
图2。噬菌体介导的生物发光检测Y 的鼠疫在时间0时，记者噬菌体和细胞混合，在29 ° C培养，生物发光（RLU）随着时间的推移监测。一个RLU显着增加（*学生t检验，P <0.05）是显而易见的，在15分钟内。

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Discussion: “发光法”的分类检测细菌病原体的记者噬菌体

这种方法证明了记者的噬菌体的能力，以快速检测Y 。因为记者噬菌体的菌可以发光信号转导的一个培养Y 。 鼠疫细胞在20分钟后，噬菌体此外。记者噬菌体也能够直接检测Y。鼠疫在临床上的矩阵，没有隔离的前提条件和后续培养 7 。相比标准的噬菌体裂解试验，一般需要48小时完成，这大大降低了检测时间。

以往的研究表明，ΦA1122野生型噬菌体可以裂解几乎所有的自然Y。鼠疫杆菌菌株，是“具体” 为 Y 鼠疫 6,10,11;然而，一些Y。 pseudotuberculosis株已被证明是生长在温度高于20 °彗星6,10,12ΦA1122易感。对温度敏感的不同的易感性的原因不明，但可能是因为在细胞的表面层/组成的温度依赖性变化。因此，记者噬菌体检测系统的潜在需要注意的是与株密切相关的物种 Y。的假阳性反应的可能性pseudotuberculosis。执行限制性温度（20℃）记者噬菌体检测，将防止一个假阳性信号，样品中可能含有Y。 pseudotuberculosis。因此，特异性，可使用时严格控制在一个特定的温度下生长的孤立文化。

总之，快速检测和诊断Y 的鼠疫是必不可少的一个积极的预后鼠疫以来，特别是肺鼠疫，几乎总是致命的，如果治疗不发病后第24小时内管理。这种方法培养分离鉴定证实或临床相关矩阵内，以满足这些需求的潜力。

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Disclosures: “发光法”的分类检测细菌病原体的记者噬菌体

没有利益冲突的声明。

Acknowledgements: “发光法”的分类检测细菌病原体的记者噬菌体

这项研究是支持小企业创新研究计划，美国国立卫生研究院（NIAID的，1R43AI082698 - 01）和美国农业部国家食品和农业研究所（NifA蛋白，2009-33610-20028）。

Materials: “发光法”的分类检测细菌病原体的记者噬菌体

Name Company Catalog Number Comments
Difco LB agar, Miller VWR international 90003-346
Difco LB broth, Miller VWR international 90003-350
17 x 100 mm culture tubes USA Scientific, Inc. 1485-0810
n-Decanal Sigma-Aldrich D7384
Veritas microplate luminometer Turner Biosystems 9100-001
Microlite microtiter 96-well plate VWR international 62402-984

References: “发光法”的分类检测细菌病原体的记者噬菌体

  1. Darling, R.G., Catlett, C.L., Huebner, K.D., & Jarrett, D.G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am 20, 273-309 (2002).
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