"Bioluminescent 'Phage Reporter para a detecção de patógenos bacterianos Categoria A

1. Y. pestis inoculação placa

1. Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) em culturas de Luria-Bertani (LB) ágar (Miller). Use técnica estéril e executar todas as Y. manipulações pestis em um tipo II classe A biossegurança gabinete. Y. pestis A1122 é um Nível de Biossegurança (BSL) 2 estirpe agente excluídos selecionar. Falta-lhe tanto os 75 kb par de cálcio de baixa virulência de resposta (LCR) plasmídeo, eo locus pgm que são necessários para a virulência. Crescer Y. pestis a 28 ° C por 48 h em uma temperatura controlada de ar estática incubadora. A taxa de crescimento de Y. pestis é lento com um tempo de geração de 1,25 h ^9.

2. Y. pestis líquido media inoculação

1. Transferência de um único Y. pestis colônia em um estéril 17 x 100 milímetros tubo de cultura contendo 2 mL de caldo LB usando um loop de inoculação estéril metal. Selecione uma colônia que é uniforme em tamanho, é indicativo de outras colônias, e é claramente separada do resto das colônias na placa. Tubo de vórtice brevemente e crescer a cultura a 28 ° C por aproximadamente 20 h em uma incubadora de agitação (225 rpm).

3. Y. conseqüência pestis, além fago repórter, e detecção bioluminescentes

1. Diluir o Y. overnight pestis 1:20 cultura em caldo LB fresco em um tubo falcon de 50 mL (por exemplo, 500 mL de células em 9,5 mL de meio) e crescer a 28 ° C com agitação (225 rpm). Crescer até uma densidade óptica a 600 nm (A ₆₀₀₎ de 0,2 é atingido (cerca de 5 h). Células em crescimento activo são preferíveis para a detecção desde a capacidade dos fagos para transduzir uma resposta bioluminescentes está correlacionada com a viabilidade e adequação das bactérias host. No entanto, o sistema de detecção foi mostrado para ser compatível com células colhidas em todas as fases do ciclo de crescimento ^7.
2. Gerar o substrato necessário para a reação bioluminescente, preparando uma solução de 2% n-Decano. Misturar 200 mL de n-Decano com 9,8 mL de caldo LB. Vortex vigorosamente durante 5 s. Primeiro a microplaca luminômetro injector com 2 mL da solução 2% n-Decano. Pré-definir o luminômetro para autoinject 67 mL da solução decanal a cada microplaca e logo em seguida ler a amostra para 10 s.
3. Dispense um alíquotas mL de caldo LB em 3 tubos de cultura. Adicionar 20 mL da solução-mãe repórter fago (estoque de 5 x 10 ⁹ unidades formadoras de placa [UFP] / mL) a cada tubo; o fago e amostras de mídia só serve como um controle negativo. Na ausência de Y. células pestis, a adição do fago repórter não deve provocar uma resposta bioluminescente.
4. Dispense um alíquotas mL da Y. pestis cultura (a partir do passo 3.1) em 6 tubos de cultura. Adicionar 20 mL do estoque fago repórter a 3 das culturas (culturas de teste). Os restantes três culturas servir de "células sozinho 'controle negativo (autobioluminescence fundo). Mix culturas em vortex brevemente, e 200 mL de colheita de cada amostra (para o tempo 0 lido) e dispensar em uma placa de microtitulação de 96 poços branco. Incubar a cultura restantes a 28 ° C com agitação (225 rpm).
5. Medir o tempo 0 amostras para bioluminescência (unidade relativa de luz, RLU), utilizando o luminômetro.
6. ML colheita 200 de cada amostra após 10, 20, 30, 40, 50 e 60 min Além fago pós-repórter, e medir a amostra de bioluminescência. Se Y. pestis células estão presentes, o fago repórter vai se ligam especificamente para a célula, injetar seu DNA, e usar o hosts maquinaria transcricional e translacional para transcrever e traduzir os genes repórter luxAB (Figura 1).
7. A força do sinal eo tempo de resposta do sinal é proporcional ao número de células presentes. Em altas concentrações de células (10 ^{5 a 10 8} UFC / mL), um aumento significativo na RLU comparados com os controles devem ser evidente dentro de 20 min. Em concentrações mais baixas de células, (10 ² -10 ⁴ UFC / mL), um aumento significativo na RLU deve ser evidente dentro de 40-60 min.
8. Como alternativa, para agilizar o processo de detecção sem a necessidade de Y. pestis conseqüência, uma colônia de uma placa de recém-cultivada pode ser misturado (em vórtice) diretamente em um tubo eppendorf 1,5 mL com 200 mL de caldo LB abrigar o fago repórter. Dispense a mistura de células / fago em um poço de uma placa de microtitulação. Incubar a placa de microtitulação a 28 ° C e ler a amostra para bioluminescência após 60 min (único momento apenas).

4. Resultados representativos:

A experiência é claro representante tempo de fago repórter mediada detecção de Y. pestis é retratado na Figura 2. Os controles negativos de 1) fago sozinho (sem células), ou 2) células sozinho (sem fago) fornecem níveis basais de bioluminescência de aproximadamente 20 em todo o RLU 60 min incubation (níveis basais são específicos luminômetro). Em contraste, um aumento de bioluminescência para as amostras de teste (fago repórter e células) é evidente aos 15 min após a adição do fago. A intensidade do sinal deve aumentar de forma constante durante 60 min. Incubações por períodos de tempo prolongado (mais de 80 min), resultará em um sinal de que vai diminuir a partir do sinal de pico devido à lise mediada fago das células do hospedeiro. Resultados semelhantes foram obtidos em temperaturas de incubação de 37 ° C, embora a temperatura ótima para Y. crescimento pestis é de 28 ° C ^9.

Figura 2. Phage mediada detecção bioluminescente de Y. pestis. No tempo 0, fago repórter e as células foram misturadas, incubados a 28 ° C, e bioluminescência (RLU) foi monitorado ao longo do tempo. Um aumento significativo em RLU (* Estudantes t-test, p <0,05) é evidente dentro de 15 min.

Este método demonstra a capacidade do fago repórter para detectar rapidamente Y. pestis desde o fago repórter pode converter uma resposta de sinal bioluminescente para Y. cultivadas pestis células dentro de 20 min após a adição do fago. O fago repórter também é capaz de detectar diretamente Y. pestis em matrizes clínico, sem o pré-requisito de isolamento e cultivo de ⁷ subseqüente. Em comparação com os ensaios fago padrão de lise, que normalmente exige 48 h para a conclusão, este diminui significativamente o tempo de detecção.

Estudos anteriores demonstraram que o tipo selvagem fago ΦA1122 pode lisar quase todos naturais Y. pestis isolados, e é "específica" para Y. pestis ^6,10,11, porém alguns Y. cepas pseudotuberculosis foram mostrados para ser ΦA1122 suscetíveis quando cultivada em temperaturas acima de 20 ° C ^6,10,12. A razão para a suscetibilidade diferencial de temperatura-sensível é desconhecida, mas provavelmente devido à temperatura-dependente mudanças nas camadas de superfície celular / composição. Portanto, uma ressalva potencial do sistema de detecção de repórter fago é a possibilidade de uma resposta falso-positivo com cepas da estreitamente relacionados espécies Y. pseudotuberculosis. Realização do ensaio fago repórter na temperatura restritiva (20 ° C) vai impedir que um falso sinal positivo nas amostras que podem conter Y. pseudotuberculosis. Assim, a especificidade pode ser estritamente controlada ao usar culturas isoladas crescido a uma temperatura específica.

Na detecção de resumo, rápido e diagnóstico de Y. pestis é essencial para um prognóstico positivo, pois a praga, a peste pneumônica, especialmente, é quase sempre fatal se o tratamento não é administrado dentro das primeiras 24 horas após o início dos sintomas. Este método tem o potencial de atender a essas necessidades para a identificação confirmada de isolados cultivados ou dentro de matrizes clinicamente relevantes.