Phage »Bioluminescent" Reporter pour la détection des bactéries pathogènes de la catégorie A

1. Y. l'inoculation plaque pestis

1. Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) les cultures de stock sur Luria-Bertani (LB) agar (Miller). Utiliser une technique stérile et effectuer toutes Y. manipulations pestis dans un type de classe II A enceinte de sécurité biologique. Y. pestis A1122 est un confinement de niveau (BSL) 2 souche exclus agent de sélection. Il manque à la fois les 75 paires ko faible teneur en calcium de réponse (LCR) plasmide de virulence, et le locus PGM qui sont nécessaires pour la virulence. Cultivez Y. pestis à 28 ° C pendant 48 h dans une température d'air statique contrôlé incubateur. Le taux de croissance de Y. pestis est lente avec un temps de génération de 1.25 h ^9.

2. Y. pestis milieux liquides d'inoculation

1. Transfert d'un seul Y. pestis dans une colonie de stériles 17 x 100 mm tube de culture contenant 2 ml de bouillon LB utilisant une boucle métallique stérile inoculation. Sélectionnez une colonie qui est uniforme dans la taille, est révélateur des autres colonies, et il est clairement séparé du reste des colonies sur la plaque. Vortex brièvement et développer la culture à 28 ° C pendant environ 20 h dans un incubateur agitateur (225 rpm).

3. Y. excroissance pestis, outre phage journaliste, et la détection de bioluminescence

1. Diluer le nuit Y. 01:20 pestis en bouillon de culture LB frais dans un tube Falcon de 50 ml (par exemple, 500 ul de cellules dans 9,5 ml de milieu) et de croître à 28 ° C avec agitation (225 rpm). Croître jusqu'à une densité optique à 600 nm ₍₆₀₀ A) de 0,2 est atteinte (environ 5 h). Cellules en croissance active sont préférables pour la détection puisque la capacité du phage pour transduire une réponse bioluminescents est corrélée à la viabilité et l'aptitude de la bactérie hôte. Néanmoins, le système de détection a été montré pour être compatible avec les cellules récoltées à tous les stades du cycle de croissance de ^7.
2. Générer le substrat nécessaire à la réaction de bioluminescence en préparant un 2% de n-décanale solution. Mélanger 200 uL de n-décanale avec 9,8 ml de bouillon LB. Vortex vigoureusement pendant 5 s. Premier la microplaque luminomètre injecteur avec 2 mL de 2% du n-décanale solution. Pré-régler le luminomètre d'autoinject 67 ul de la solution décanale à chaque puits de microplaque puis lire immédiatement l'échantillon pendant 10 s.
3. Distribuer des aliquotes de 1 ml de bouillon LB en 3 tubes de culture. Ajouter 20 ul de la solution stock journaliste phage (stock de 5 x 10 ⁹ unités formant plaque [UFP] / ml) dans chaque tube, les phages et les médias seuls échantillons sert de contrôle négatif. En l'absence de Y. cellules pestis, l'ajout du phage journaliste ne devrait pas susciter une réaction de bioluminescence.
4. Distribuer des aliquotes de 1 mL de la Y. la culture pestis (de l'étape 3.1) dans 6 tubes de culture. Ajouter 20 uL de la journaliste de stock de phages à 3 sur les cultures (cultures d'essai). Les 3 autres cultures servir de «cellules seules« contrôle négatif (autobioluminescence fond). Mélanger les cultures au vortex brièvement, et la récolte 200 ul de chaque échantillon (pour l'instant 0 en lecture) et répartir dans une plaque de microtitration de 96 puits blanc. Incuber la culture reste à 28 ° C avec agitation (225 rpm).
5. Mesurer le temps 0 échantillons de la bioluminescence (unités relatives de lumière, RLU) en utilisant le luminomètre pour microplaques.
6. Récolte 200 ul de chaque échantillon après 10, 20, 30, 40, 50 et 60 min après ajout de phages-reporter, et de mesurer l'échantillon de la bioluminescence. Si Y. cellules pestis sont présents, le phage rapporteur sera lient spécifiquement à la cellule, injecter son ADN, et d'utiliser les machines hôtes transcription et de traduction de transcrire et de traduire les gènes rapporteurs luxAB (figure 1).
7. La force du signal et le temps de réponse du signal est proportionnelle au nombre de cellules présentes. À des concentrations élevées de cellules (10 ⁵ -10 ⁸ UFC / ml), une augmentation significative en RLU par rapport aux contrôles devrait être évident dans les 20 min. A des concentrations inférieures cellulaire, (10 ² -10 ⁴ UFC / ml), une augmentation significative des AVC devrait être évident dans les 40-60 min.
8. Sinon, pour accélérer le processus de détection sans avoir besoin de Y. excroissance pestis, une colonie d'une plaque fraîchement cultivées peuvent être mixtes (au vortex) directement dans un tube Eppendorf de 1,5 ml avec 200 pi de bouillon LB abritant le phage journaliste. Répartir le mélange de cellules / phages dans un puits d'une microplaque. Incuber la microplaque à 28 ° C et de lire l'échantillon de la bioluminescence après 60 min (seul moment seulement).

4. Les résultats représentatifs:

Une expérience représentative du temps bien sûr du phage journaliste de médiation de détection de Y. pestis est représenté dans la figure 2. Les contrôles négatifs de 1) phage seul (sans cellules), ou 2) des cellules seules (pas le phage) de fournir des niveaux de référence de la bioluminescence d'environ 20 RLU dans le inc 60 minubation (niveaux de référence sont spécifiques luminomètre). En revanche, une augmentation de la bioluminescence pour les échantillons d'essai (phage journaliste et cellules) est évidente à 15 minutes après l'addition de phages. La force du signal devrait augmenter régulièrement plus de 60 min. Les incubations pour des périodes prolongées (plus de 80 min), se traduira par un signal qui va diminuer à partir du signal de pointe en raison de phage lyse des cellules hôtes. Des résultats similaires sont obtenus à des températures d'incubation de 37 ° C même si la température optimale pour Y. la croissance pestis est de 28 ° C ^9.

Figure 2. Phage médiée par la détection de bioluminescence de Y. pestis. Au temps 0, phage journaliste et les cellules ont été mélangés, incubées à 28 ° C, et la bioluminescence (AVC) a été suivi dans le temps. Une augmentation significative des AVC (* Etudiants t-test, p <0,05) est évidente dans les 15 min.

Cette méthode démontre la capacité du phage journaliste de détecter rapidement Y. pestis depuis le phage journaliste peut transduire un signal de réponse à la culture bioluminescents Y. cellules pestis dans les 20 minutes après l'addition de phages. Le phage journaliste est également capable de détecter directement Y. pestis dans des matrices cliniques, sans le préalable de l'isolement et la culture ⁷ ultérieures. Par rapport à la lyse de phages tests standard qui exigent généralement 48 h pour l'achèvement, ce qui diminue considérablement le temps de détection.

Des études antérieures ont démontré que le phage de type sauvage ΦA1122 peuvent lyser presque tous naturels Y. pestis isolats, et est "spécifique" pour Y. pestis ^6,10,11; cependant, certains Y. pseudotuberculosis souches ont été montré pour être ΦA1122 sensible lorsqu'il est cultivé à des températures supérieures à 20 ° C ^6,10,12. La raison de la sensibilité différentielle sensibles à la température est inconnue, mais probablement en raison de changements dépendant de la température dans les couches superficielles de cellules / composition. Par conséquent, une mise en garde potentielle du système de détection journaliste de phage est la possibilité d'une réponse de faux-positifs avec les souches de l'Y. étroitement liés espèces pseudotuberculosis. La réalisation du test phage journaliste à la température restrictive (20 ° C) permettra d'éviter un faux signal positif dans les échantillons qui peuvent contenir des Y. pseudotuberculosis. Ainsi, la spécificité peut être strictement contrôlée en utilisant des cultures isolées cultivés à une température spécifique.

En résumé, la détection et le diagnostic rapides de Y. pestis est indispensable pour un pronostic positif depuis la peste, la peste pneumonique en particulier, est presque toujours mortelle si le traitement n'est pas administré dans les 24 premières heures après l'apparition des symptômes. Cette méthode a le potentiel pour répondre à ces besoins pour l'identification des isolats confirmés en culture ou dans des matrices cliniquement pertinents.