Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

1, 1, 2, 1

1Department of Biology, University of Florida, 2Mount Desert Island Biological Laboratory

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 107.20.129.212, User IP: 107.20.129.212, User IP Hex: 1796506068

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745, doi:10.3791/2745 (2011).

Abstract: High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

High-throughput screening (HTS) är en kraftfull metod för att identifiera kemiska modulatorer av biologiska processer. Men många föreningar identifierats i skärmarna med hjälp av modeller cellodling ofta visat sig vara giftiga eller farmakologiskt inaktiva in vivo 1-2. Screening helt djurmodeller kan hjälpa till att undvika dessa fallgropar och effektivisera vägen till läkemedelsutveckling.

C. elegans är en flercellig modellorganism lämpar sig väl för HTS. Den är liten (<1 mm) och kan vara ekonomiskt odlas och distribueras i vätskor. C. elegans är också en av de mest experimentellt tractable djurmodeller behövs för en snabb och detaljerad kartläggning av droger mode-of-åtgärd 3.

Vi beskriver ett protokoll för odling och utlämning fluorescerande stammar av C. elegans för high-throughput screening av kemiska bibliotek eller upptäckt av miljögifter som ändrar uttrycket av en specifik gen. Ett stort antal utvecklingsmässigt synkroniserad maskar odlas i flytande kultur, skördade, tvättade och suspenderade i en definierad densitet. Maskar läggs därefter till svart, flatbottnade 384-brunnars plattor med en peristaltiska flytande dispenser. Små molekyler från ett kemiskt bibliotek eller prover (t ex vatten, mat eller jord) kan läggas till brunnar med maskar. In vivo är realtid fluorescensintensiteten mäts med en fluorescens mikroplattor läsare. Denna metod kan anpassas till alla inducerbara genen i C. elegans som en lämplig reporter är tillgänglig. Många inducerbara stress och utvecklande transkriptionsvägar är väl definierade i C. elegans och GFP transgena stammar reporter finns redan för många av dem 4. I kombination med lämplig transgena reportrar, kan vår metod kan användas för att screena för väg modulatorer eller att utveckla robusta biosensor analyser för miljögifter.

Vi visar vår C. elegans kultur och utlämning protokoll med en HTS analys vi utvecklat för att övervaka C. elegans cap 'n' kragen transkriptionsfaktor SKN-1. SKN-1 och dess däggdjur Nrf2 homolog aktivera cytoprotective gener under oxidativ och xenobiotiska stressen 5-10. Nrf2 skyddar däggdjur från många åldersrelaterade sjukdomar såsom cancer, neurodegeneration och kronisk inflammation och har blivit ett stort kemoterapeutiska mål 11-13. Vår analys är baserad på en GFP transgena reporter för SKN-1 målgenen gst -4 14, som kodar en glutation-S transferas 6. Den GST -4 reportern är också en biosensor för xenobiotiska och oxidativ kemikalier som aktiverar SKN-1 och kan användas för att detektera låga halter av föroreningar som akrylamid och metylkvicksilver 15-16.

Protocol: High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

1. Beredning av bakteriell mask mat

Dag 1

  1. Tillsätt 5 ml mättad E. coli OP50 bakterieodling till 500 ml Terrific buljong kompletteras med 50 mikrogram / ​​ml streptomycin och växa i en skakande inkubator (225 rpm) över natten vid 37 ° C.

Dag 2

  1. Dela natten bakterieodling i tio 50 ml rör och bakterier centrifug i en kyld centrifugera vid 2500 RCF i 20 minuter.
  2. Dekantera av LB buljong och återsuspendera varje bakteriell pelleten i 10 ml flytande medier rundmasken tillväxt (NGM). Skaka horisontellt i ett golv shaker i 15 minuter för att resuspendera bakterier. För att göra NGM buffert, tillsätt 3 gram NaCl till 1 L avjoniserat vatten och autoklav. Kyl till 55 ° C och tillsätt för följande sterila lösningar: 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1 M MgSO 4, och 25 ml 1 M kaliumfosfat, pH 6,0.
  3. Centrifugera bakterieodling i en kyld centrifugera vid 2500 RCF i 20 minuter.
  4. Dekantera av NGM buffert och väga den bakteriella pelleten.
  5. Tillsätt en motsvarande volym av NGM buffert resuspendera pellets, delprov 3 ml bakterier koncentratet i 15 ml rör och förvaras vid -20 ° C.

2. Storskaliga C. elegans flytande kultur

Vi använder en transgen linje VP596 (dvIs19 [pAF15 (GST-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [DOP-3:: RFP]) bär två lysrör konstruktioner: Pgst -4:: GFP 14 för att övervaka SKN-1 aktivitet och PDOP-3:: RFP 17 att fungera som en standard för mask nummer normalisering.

Dag 1

  1. Blanda 150 ml NGM buffert, 1,5 ml LB buljong, 150 l av 5 mg / ml kolesterol (i etanol) och 75 l på 100 mg / ml streptomycin. Filter-sterilisera blandningen och lägg till en 1 liters steril kolv.
    OBS: Lägga till 1% LB buljong till NGM buffert hjälper till att förhindra maskar fastnar på glas och plasten, men detta belopp inte är tillräckligt för att stödja bakterietillväxt.
  2. Synkronisera maskar med standarden hypoklorit förfarandet 18. Upp till 0,5 ml gravid maskar kan bearbetas i en enda 15 ml rör med 5 ml hypokloritlösning (3,75 ml sterilt vatten, 1 ml blekmedel, och 250 l 10 N NaOH). Tvätta ut äggen med sterilt vatten och återsuspendera dem i 10 ml NGM buffert.
  3. Späd ett urval av de ägg 100 gånger i NGM buffert (t.ex. 100 l i 10 ml) och räkna antalet ägg i tre separata 5 l alikvoter. Flera genomsnittligt antal av 200 tusen (100 spädningsfaktorn x 2000) för att uppskatta det totala antalet ägg.
  4. Lägg 200.000 till 2 miljoner ägg i kolven med NGM buffert och skaka den kultur vid 100 rpm vid 20 ° C.

Dag 2

  1. Minst 16 timmar efter att ha lagt ägg till kolven, använd en steril serologisk pipett för att ta bort cirka 0,5 ml av den avstängda masken kulturen. Pipettera tre 5 l droppar på den sterila locket på en petriskål. Placera locket i en -20 ° C frys i 1-2 minuter att paralysera maskar. Räkna genomsnittliga antalet levande kläckts maskar per 5 l och sedan flera med 30.000 (150 ml / 5 l) för att uppskatta det totala antalet kläckta maskar.
  2. Tina ett rör av frysta OP50 bakteriekultur (protokoll 1,6) och tillsätt 3 ml 50% OP50 i masken kulturen per 500.000 kläckts maskar. Skaka kolven vid 100 rpm vid 20 ° C. Maskar kommer att utvecklas till L4 larver och unga vuxna i ca 51 timmar. Den OD600 av bakterier bör vara ca 2,200 i början. Övervaka mängden bakterier genom absorption och tillsätt mer om OD 600 sjunker under 0,900.

3. Worm insamling och dispensering

Dag 4

  1. Använd en steril serologisk pipett överföra cirka 0,5 ml av suspenderade masken kulturen till en standard NGM agarplatta. Visa maskar med ett stereomikroskop att se till att de flesta är L4 eller unga vuxna. L4 har en ventral tydlig plats i mitten av kroppen. Unga vuxna kommer att bli något större och kommer inte att ha en tydlig plats.
  2. Häll masken kultur i sterila 50 ml rör och placera rören i ett provrör rack på bänk. Låt maskarna att bosätta sig i ca 10 minuter. Avlägsna supernatanten genom aspiration eller pipettering.
    OBS: Detta steg kan vara viktigt att ta bort okläckta ägg eller maskar som inte utvecklas eftersom de kommer att bosätta sig långsammare än L4 och unga vuxna.
  3. Samla alla maskar i en enda 50 ml rör och tvätta med NGM buffert med 1% LB buljong (NGM + LB) 3-4 gånger för att ta bort bakterier.
    OBS: Detta görs bäst i en svängig-hink centrifugen genom att samla maskar vid 500 RCF i 30 sekunder och ersätta supernatanten med färska NGM + LB buffert.
  4. Efter tvättning, fyller röret med NGM + LB buffert till 50 ml och häll i en egen mask dispensering kolv. Lägg en liten omrörare och rör för att hålla maskarna upphävas. Räkna the antal maskar i tre 5 l droppar som anges ovan. Späd med NGM + LB tills du får 12-15 maskar per 5 l droppe (~ 2,5-3,0 maskar / l).
    OBS: Minst ca 20 ml (60 tusen maskar) behövs för att fylla de döda utrymme utlämning kolven och dispenser kassett. Varje 384 brunnar kräver ca 35.000 maskar eller 11,5 ml av suspenderade maskar.
  5. Ladda en 10 l dispensering kassett och sterilisera grundning med 70% etanol. Skölj ur etanol grundning med sterilt vatten.
  6. Sätt in i slutet av utlämning kassetten i kolven så att det är precis ovanför omrörare utan att störa dess rörelse. Se till att maskarna hålla sig svävande i hela kolven. Programmera dispensern att dosera i låg hastighet med 2 pre-pulser. Prime och kör minst 10 ml av suspenderade maskar. Fyll plattor som behövs snabbt för att förhindra att maskar från att landa i slangen.
  7. Täta plattor med andas tejp.
  8. Placera plattorna på en skakande plattform i en inkubator vid lämplig temperatur för din analys. Stapla inte plattorna.

4. Fluorescens analys

  1. Placera måltavla i en mikroplattor läsaren att mäta fluorescens intensiteten i varje brunn med lämpliga utsläppsnormer och excitationsvåglängden (Filter för vår analys: GFP 485/20ex 528/20em, RFP 540/25ex 590/35em).
  2. Beräkna kvoten av GFP / RFP och normalisera med värdena från de kontrollbrunnarna (utan att aktivera förening) att fastställa den exakta faldig skillnad i fluorescensintensiteten som härletts från individuella behandlingar.

5. Representativa resultat:

Vår SKN-1-analysen använder en kromosomalt integrerad dubbel reporter stam (VP596). Som visas i figur 1, är antalet maskar väl korrelerad till undvaras volym. Som visas i figur 2A och 2B, totalt GFP och RFP fluorescens per brunn är mycket reproducerbar från väl till väl över en 384 brunnar. Som visas i figur 2C, FN-inducerad Pgst-4:: GFP fluorescens är linjärt korrelerad till PDOP-3:: RFP över 384 brunnar. Uttryckt som en kvot av GFP / RFP blir fluorescens mycket reproducerbar från väl till väl över en 384 brunnar (jämför variationskoefficient från figur 2D till 2A) visar förmåga PDOP-3:: RFP reporter för att minska variabilitet. Som framgår av Figur 3, induktion av GFP i förhållande till RFP med en SKN-1 aktiverar xenobiotiska (38 mikroM juglone) är robust och mycket reproducerbara över en 384 brunnar.

Figur 1
Figur 1. Antalet maskar förhållande till volym undvaras. Worms var utspädd till ca 2/μl och dispenseras i en 24 brunnar för manuell räkning med ett stereomikroskop. N = 8 brunnar per volym.

Figur 2
Figur 2. Totalt fluorescens maskar droppats in en 384 brunnar är reproducerbara. Worms var utspädd till ca 2.5/μl och 30 l var doseras i varje brunn i en 384 brunnar. GFP (A) och RFP (B) fluorescens av alla brunnar hade en variationskoefficient under 9%. (C) GFP fluorescens är starkt korrelerad till RFP fluorescens. (D) Beräkning av förhållandet mellan GFP till RFP minskat variationskoefficienten till under 6% (A, B och D) Fast linjerna anger de medel och brutna linjer anger tre standardavvikelser över eller under medelvärdet.

Figur 3
. Figur 3 Aktivering av Pgst-4:: GFP är robust och konsekvent. Cirka 75 L4 maskar doseras i alla brunnarna på en 384 brunnar och 38 mikroM juglone inkom i varannan kolumn. GFP och RFP fluorescens mättes efter 21 h inkubation. Den genomsnittliga relativa fluorescens förhållandet mellan all kontroll (1,0) och juglone brunnar (8,9) är markerade med heldragna linjer. Tre standardavvikelser över kontrollen innebär och under juglone menar är markerade med streckade linjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

Vi presenterar en metod för odling och utlämning stort antal transgena nematoder. Den utrustning som används för odling maskar är standard för laboratorier som utför molekylär kloning och vätskehantering och fluorescens utrustning är standard för laboratorier bearbetning stort antal mikroplattor. Andra metoder för dispensering stort antal av levande C. elegans kräver dyra partikelfilter sorteringsutrustning 19. Den Pgst-4:: GFP-analysen kan användas för att screena för liten molekyl modulatorer av cap 'n' krage transkriptionsfaktorer och för att upptäcka xenobiotiska och oxidant föroreningar i miljö-och livsmedelsprover 14,16. Robust inducerbara transgena GFP reportrar finns för ett brett sortiment av vägar och miljömässiga stimuli 4, och därmed vår metod bör tillämpas för att utveckla modulatorer av många vägar och för att upptäcka ett brett spektrum av föroreningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements: High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

C. elegans transgener lämnades av Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Detta arbete stöddes av NIH R21 bevilja NS0667678-01 till KS. Alla författare har deltagit i insamling, analys och tolkning av data. CKL, KS, och KPC deltagit i att skriva och revidera manuskriptet.

Materials: High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

Name Company Catalog Number Comments
LB broth Research Products International Corp. L24066
Terrific broth Research Products International Corp. T15100
Synergy HT Multi-mode Microplate Reader BioTek Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em
MicroFlo Select Dispenser BioTek
Worm dispensing flask Southern Scientific Inc., Micanopy, FL Custom assembled(352) 284-2531
384 microplates Greiner Bio-One 5678-1209
Breathable sealing tape Nalge Nunc international 241205
(5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone Acros Organics 121640010 Juglone is dissolved in DMSO
DMSO Sigma-Aldrich D-5879
C. elegans transgenic strain Author’s laboratory VP596 Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP

References: High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

  1. Simeonov, A. et al. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis 2, e127 (2008).
  2. Giacomotto, J. & Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we? Br J Pharmacol 160, 204-216 (2010).
  3. Artal-Sanz, M., de Jong, L. & Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J 1, 1405-1418 (2006).
  4. WormBase. <www.wormbase.org> (2010).
  5. An, J. H. & Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
  6. Choe, K., Przybysz, A. & Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol 29, 2704-2715 (2009).
  7. Hasegawa, K. et al. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
  8. Tullet, J. M. A. et al. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell 132, 1025-1038 (2008).
  9. Oliveira, R. P. et al. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell in press (2009).
  10. Park, S.-K., Tedesco, P. M. & Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell 8, 258-269 (2009).
  11. Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S. & Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal (2010).
  12. Kwak, M. K. & Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol 244, 66-76 (2010).
  13. Leiser, S. F. & Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol 30, 871-884 (2010).
  14. Link, C. D. & Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505. (2002).
  15. Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G. & Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci (2010).
  16. Hasegawa, K. et al. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett 175, 82-88 (2007).
  17. Chase, D. L., Pepper, J. S. & Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience 7, 1096-1103 (2004).
  18. Hope, I. A. C. elegans, a Practical Guide. (Oxford University Press, 2005).
  19. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol 351, 275-286 (2006).

Ask the Author: High-throughput screening och biosensing med fluorescerande C. elegans Stammar

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter