Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

1. İntrakranial virüs enjeksiyonu:

AÅŸağıdaki teknik deÄŸiÅŸtirilmiÅŸ ve laboratuar ve meslektaÅŸları tarafından yaygın olarak kullanılmıştır. Kısaca, intrakranial enjeksiyon Theiler fare ensefalomiyelit virüsü (TMEV) veya sahte-enfeksiyon Daniel suÅŸu (1, 10) beyin infiltre lökositler (BILs) ortaya çıkarmak için genç farelerde (yaÅŸ tercihen 5-6 hafta) yapılır. Daniel zorlanma, fasulye zorlanma ve GDVII suÅŸu arasında farklılık olacağını lütfen unutmayınız. BILs hasat amaçla, fareler TMEV, 2x10 ⁵ PFU almak ve 24 saat için bulaÅŸmış.

1. Otomatik olarak 1 ml Hamilton şırınga, bir iğne (27 gauge ¼ Kendall) takın ve virüsü 10 ul teslim ayarlayabilirsiniz.
2. 10 mcL DMEM içinde TMEV hava kabarcıkları dikkat şırıngaya çekin. Uygun olduğunda, sahte enfekte olmuş fareler virüs DMEM 10 ul alırsınız.
3. Enjeksiyondan hemen önce, izofluran yaklaşık 1 ml altında pamuk substrat ile bir tel ızgara içeren bir fanus içine dökün.
4. Toe-tutam duyarsız ve uçucu anestezik immobilize çan kavanoz tel ızgara üzerine koyun fareler direclty hafif anestezi olana kadar, yaklaşık 10-15 saniye. Fare rahatsız edici ve kostik madde gibi, izofluran ile doğrudan temas etmemelidir.
5. Fareler anestezi altında iken, tıraş ve mürekkep kullanılarak kafatası frontal korteks bölgede hızlı bir şekilde uygun koordinatları enjeksiyon için hazırlar. Enjeksiyon için genel konumu bregma için ön 1 mm ve 1 mm sagital sütür (Şekil 1) sağ tarafta lateral. Stereotaktik enjeksiyon bazı deneysel durumlar için uygun olsa da, biz, mürekkep ya da tıraş olmadan ücretsiz el enjeksiyon deneylerin çoğunluğu için uygun olduğunu buldular. Her iki eksen boyunca iğne ucu ile kürk Kesme enjeksiyon için uygun.
6. Bir enjeksiyon yapmak için, şark yaklaşık 3 mm derinliğe kadar kafatası ve kemik aracılığı ile basın iğne dik.
7. Hamilton şırınga düğmesine basarak ve çekilmeden önce beyin girmek için virüs için 2 saniye bekledikten beyin içine Express virüs.
8. Dikkatlice iÄŸneyi çıkarın ve temiz, kuru bir kafes içinde fare. Fare anesteziden hızlı bir ÅŸekilde uyanırsınız ve birkaç dakika içinde normal iÅŸlevini devam ettirmek. Hayvan ötenazi olarak enjeksiyon yerinde aşırı kanama, anormal belirtileri sergileyen fareler uygun önem vermek uygun olabilir. Uygun hayvan SaÄŸlığı ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallar National Institutes ⁶ ve baÄŸlılığı ele takip edilmelidir.

2. Beyin-infiltre lökosit hücre hazırlama:

1. , 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll ve 1 ml 10X PBS ve tüpler beyin kaldırma işlemi sırasında, bankta RT oturup, 30 ml kapasiteli tutabilir yuvarlak alt Oak Ridge santrifüj tüplerine hazırlayın.
2. Oda sıcaklığında (RT) Ficoll-Paque Plus getirin.
3. DeÄŸiÅŸtirilmiÅŸ izofluran doz aşımı ⁵ hayvan Euthanize ve hızlı bir ÅŸekilde buz üzerinde 5 ml RPMI içeren 15 ml konik bir tüp, paslanmaz çelik bir doku spatula ve yer kullanarak beyin kaldırmak. Bazı durumlarda, PBS-perfüzyon BILs hazırlanması periferik kan hücreleri dolaÅŸan kaldırmak için uygun olabilir. Fare, tam ve doÄŸru olarak anestezi öncesinde PBS-perfüzyon olmalıdır.
4. Beyin ve 7 ml cam Pyrex marka Tenbroeck doku değirmeni RPMI çözüm aktarın ve hafifçe 10-15 vuruş ile homojenize.
5. Homojenizatör ve iki kez pipetlemeyin yukarı ve aşağı doğru pipetleyin ek bir 5 ml RPMI. Transferi beyin Homojenat (yaklaşık 10 ml), önceden hazırlanmış yuvarlak alt tüp ve invert 2-3 kez hafifçe karıştırın.
6. Beckman Allegra X-22R klinik santrifüj F0360 sabit açılı rotor RT 30 dakika 7800g _ave beyin Homojenat Spin.
7. Santrifüj sonra, degrade üst yüzen miyelin enkaz kaldırmak. Kırmızı kan hücresi pelet (Şekil 2) yukarıda yüzer lökosit tabakası toplayın.
8. 50 ml konik içine lökosit tabakası, 40 mikron hücre süzgecinden süzün. RMPI ile 50 ml hacmi çözüm getirin.
9. Spin tüpler RT az 5 dakika 1500 rpm (600g _ave) bir klinik santrifüj içeren seyreltilmiş hücre süspansiyonu.
10. Süpernatantı aspire ve hücre pelletini toplamak. 1 ml FACS Tampon pelet (% 1 sığır serum albumin,% 0.02 sodyum kalsiyum azid ve magnezyum PBS) süspanse edin ve 5 ml yuvarlak alt FACS tüpler hücre süspansiyonu aktarmak.
11. 1 ml Ficoll-Paque Plus ile dikkatlice altında yatan süspansiyon.
12. 2500 rpm (1400 verdi) hiçbir fren RT 25 dakika klinik santrifüj tüp dönerler.
13. 1 ml pipet ve yeni 5 ml FACS tüp transfer arabirimi (Şekil 2) beyaz, kabarık katmanı kaldırın. Yıkama c4 ml FACS tamponu ile arşın.
14. Pelet hücrelerin klinik santrifüj RT az 5 dakika 1500 rpm (600g _ave) tüp dönerler.
15. Süpernatant aspire ve hücre pelletini toplamak. Lökosit pelletini tekrar uygun tampon ve yeni bir FACS tüp içinde buz üzerinde tutmak.
16. Tripan mavi dışlama hücre canlılığını deÄŸerlendirmek ve flow sitometri ile analiz, hücre güvenin. Genel olarak, araÅŸtırmacılar yaklaşık 5 x 10 ⁵ hücre / hayvan satın almak için bekleyebilirsiniz.

3. Akış sitometrik işaretleyicidir

1. Lökosit sayımı ve izole sonra, klinik bir santrifüj 1500 rpm (600 _verdi), 3 dakika boyunca hücrelerinin dönerler .
2. Aşağıdaki içeren tampon engelleme pelletini tekrar: 2.4G2 hibridoma (Fc blok; anti-CD16/32) supernatant FACS tampon, 10:05:01 'lik bir oran fetal sığır serumu ve 4 30 dakika boyunca inkübe ° C .
3. Hazırlayın ve 4 1:200 ve inkübe bir konsantrasyon az 30 dakika süreyle bloke hücreleri ° C karanlıkta konjuge ekstrasellüler antijenlere karşı antikorlar ekleyin. Leke ve 200 ul hücreler, bir 96-iyi V-alt plaka kuluçkaya yatmaktadır. Uygun kontroller gerekli lekesiz hücreleri ve florokrom tazminat örnekleri, içerir.
4. 96-kuyucuğu rotor uygun bir klinik santrifüj 1500 rpm (600 _verdi) 3 dakika RT boyanan hücrelerin dönerler.
5. Süpernatantı aspire ve hücreleri hafifçe aşağı yukarı 3 kez pipetleme ve 200 ul FACS tampon ile yıkayın.
6. Yukarıdaki yıkama tekniği iki kez tekrarlayın.
7. Yıkandıktan sonra,% 2 paraformaldehid FACS tüplerine transfer hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Fixation Biyogüvenlik Seviye 2 reaktiflerin enfekte hücreleri akım sitometri analizi için gereklidir.
8. DeÄŸiÅŸtirilmiÅŸ bir akım sitometri yöntemi ⁸ BD FACS Calibur sabit hücreler çalıştırın ve çevrimdışı FlowJo, WinMDI veya diÄŸer mevcut flow sitometri analiz yazılımı kullanarak dosyaları analiz.
9. Örnek başına 50-100,000 olayların analizi genellikle yeterli işaretleyicidir için gereklidir.

Bu deneyde kullanılan doğrudan konjuge antikorları:

CD45 klon 30-F11 ile tespit edildi. Ly6C / G klon Gr1, RB6-8C5 ile tespit edildi. CD11b klonu M1/70 ile tespit edildi. F4/80 klonu BM8 ile tespit edildi.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Biz 24 saat sonrası enfeksiyon (Şekil 3) fare BILs için hücre fenotipleme sonuçları göstermektedir. Lökositler, bağışıklık hücreleri algılamak için PerCP-konjuge anti-fare CD45 ile boyandı, PE-konjuge anti-fare Ly6C / G hücreleri algılamak için inflamatuar monositler, APC-konjuge anti-fare CD11b ve APC-konjuge anti-fare F4/80 tespit etmek için monosit soy. BD FACS Calibur enstrüman analizi yapıldı.

Şekil 1. Enjeksiyon yerinde Anatomik lokalizasyon. Enjeksiyon yerinde bregma için ön 1 mm ve sağ tarafta sagital sütür 1 mm lateralinde yer alır.

Şekil 2. Lökositler ve BILs degrade ayrılması İllüstrasyon lökositler başlangıçta doğrudan miyelin enkaz katmanı altında ve Percoll degrade RBC pelet üzerinde toplanır. Ficoll degrade arayüzünde beyaz, kabarık bir katman (BILs) toplanır.

Åžekil 3. 24 saat sonrası enfeksiyon Fare lökositlerin beyin infilatrating lökositlerin immünfenotip beyin doku intrakranial enfeksiyon sonrası 24 saat hayvanlar hazırlanan homojenatlarında ayırıcı yoÄŸunluÄŸu santrifüj tarafından izole edilmiÅŸtir. Hücreler fare CD45 karşı floresan-konjuge antikor ile boyandı, Ly6C / G, CD11b ve F4/80. Ä°lk yolluk forward scatter (FSC), hücre boyutu bir göstergesi (C) karşı CD45, bağışıklık hücreleri için bir belirteç, komplo yapıldı. CD45 ^hi (A, D), CD45 ^lo (B, E), ve CD45 ^negatif (F, G) popülasyonları ardından monosit ve makrofaj belirteçlerinin Ly6C / G, F4/80 (A, B, göreceli ekspresyon düzeyleri incelendi F) ve CD11b (D, E, G). Ly6C / G ⁺ F4/80 ⁺ CD11b ⁺ inflamatuar monositler çevreden bu hücrelerin infiltrasyonu ile tutarlı CD45 ^yüksek nüfus (A, D), neredeyse sadece bulundu. Buna karşılık, Ly6C/G-F4/80 ^lo CD11b ⁺ makrofajlar CD45 ^lo (B, E) ve CD45 ^negatif (G), yerleÅŸik fenotip ile tutarlı nüfus, neredeyse sadece bulundu . Sayısız deneylerde, CD45 ^hi bulaÅŸmamış veya sahte-enfeksiyon beyin hücreleri veya Ly6C / G ⁺ F4/80 ⁺ CD11b ⁺ inflamatuar monositler asla riayet varTed fareler (veriler gösterilmemiÅŸtir).

Biz rutin beyin infiltre hücre hazırlama kalitesini belirlemek için flow sitometri ve bağışıklık hücrelerini ^{2, 9} farklı nüfusu ayırt etmek. Akut zaman noktalarında, BILs yöntemi CD45hi CD45lo nüfus makrofajların yanı sıra yüksek oranda nüfus içinde yüksek oranda inflamatuar monositlerin verir. Bu, beynin içinde bir tekrarlanabilir immün yanıt sağlam yöntemi ile karakterize edilebilir olduğunu gösterir.

Bu tekniÄŸi fare beyin bağışıklık hücreleri iyi karakterize nüfus gerektiren deneyler için özel bir önem taşımaktadır. Daha önce kuyruk damar enjeksiyonu ⁷ ile bilgisayar fareleri içine infiltre lökositler beynimizin enjekte edilerek evlatlık transferi deneyleri yapılan ve çeÅŸitli in vitro deneyler ⁹ ile BILs nitelendirmiÅŸtir. Bizim BILs hazırlık ikamet eden makrofaj ve mikroglia dahil olmak üzere, beyin yerleÅŸik hücreleri, bağışıklık hücrelerinin farklı popülasyonlar ayırmak gerekir deneyler özellikle yararlıdır. DiÄŸer bir ilginç uygulama, efektör ^{fonksiyonları} 3. belirlemek için 7 gün enfeksiyonu BILs izole edilen total RNA üzerinde yapılan gerçek zamanlı RT-PCR analizi içerir . ÖrneÄŸin, TMEV ile enfekte perforin-yetkili ve yetersiz beslenen hayvanların 7 gün enfeksiyonu toplanan BILs GAPDH, granzim B ve perforin RNA ölçülür. Ayrıca, NKG2D akut enfekte olmuÅŸ ^fareler 4 beyin takas TMEV nasıl katkıda bulunduÄŸunu belirlemek için bizim BILs yöntemi kullanılmıştır .

Yöntemin pek çok kritik yönü vardır. Lökositlerin aşırı stresten kaçınmak ve uygun dansitometrik ayırma sağlamak için ön hazırlık oda sıcaklığına kadar tüm çözümler getirmek şarttır. Stres lökosit hücre ölümü, özellikle canlı hücrelerden oluşan bir nüfus adoptively bir dizi hayvan aktarılır in vivo deneyler için onları güvenilmez kılan katkıda bulunur. Ayrıca soğuk Percoll kullanımı sadece süreksiz degrade yoğunluğu değişir, ama aynı zamanda lökositlerin kalitesini etkiler tespit ettik. Başka kritik unsur, beyin dokusu yeterli ve yumuşak homojenizasyon. Biz bu yetersiz ve kaba homojenizasyon mikroskobu ve akım sitometri ile görülen hücre artıkları bol miktarda beyin dokusu sonuçları bulduk. Hücre döküntüler de uygun boyutta hücre süzgeç ile beyin Homojenat süzme değil neden olabilir. Uygun dikkat daha fazla deney ve analiz için geniş ve yeterli BILs hazırlanması önemli.