Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

1. Virus iniezione intracranica:

La seguente tecnica è stato modificato ed utilizzato ampiamente dal nostro laboratorio e colleghi. In breve, l'iniezione di tensione intracranica Daniel di Theiler ha murino encefalomielite virus (TMEV) o sham-infezione (1, 10) viene eseguita su topi giovani (preferibilmente 5-6 settimane di età), per sollecitare leucociti cervello infiltrante (Bils). Si prega di notare che i risultati saranno diversi tra il ceppo di Daniel, il ceppo BEAN, e il ceppo GDVII. Ai fini della raccolta Bils, topi ricevere 2x10 ⁵ PFU di TMEV e sono infettate per 24 ore.

1. Applicare l'ago di iniezione (27 gauge, ¼, Kendall), a un automatico siringa da 1 ml Hamilton e impostato a consegnare 10 ml di virus.
2. Redigere TMEV a 10 L DMEM nella siringa con particolare attenzione a bolle d'aria. Se del caso, i topi infettati farsa ricevere 10 ml di virus DMEM.
3. Poco prima iniezione, versare circa 1 ml di isoflurano in una campana di vetro che contiene una griglia metallica con il substrato di cotone sotto.
4. Topi luogo direttamente sui griglia metallica nella campana di vetro fino a quando diventano leggermente anestetizzata, insensibile ai piedi, pizzico e immobilizzato dai inalanti anestetico, circa 10-15 secondi. I topi non devono venire a contatto diretto con isoflurano, come sostanza può essere irritante e caustico.
5. Mentre è sotto anestesia, preparare i topi per l'iniezione di trovare velocemente coordinate appropriate nella regione di corteccia frontale del cranio con barba e inchiostrazione. La posizione generale per l'iniezione è di 1 mm anteriore al bregma e 1 mm laterale per la sutura sagittale sul lato destro (Figura 1). Mentre l'iniezione stereotassica può essere appropriato per alcune situazioni sperimentali, abbiamo scoperto che a mano libera iniezione senza barba o inchiostrazione è adatto per la maggior parte degli esperimenti. Ripartito il pelo con la punta dell'ago lungo entrambi gli assi è appropriato per l'iniezione.
6. Per fare una iniezione, orientare la perpendicolare ago al cranio e stampa attraverso l'osso a una profondità di circa 3 mm.
7. Esprimere virus nel cervello premendo il pulsante siringa Hamilton verso il basso e attendere 2 secondi per il virus di entrare nel cervello prima di ritirarsi.
8. Rimuovere con attenzione l'ago e posizionare il mouse in un ambiente pulito, asciutto gabbia. I topi risvegliano dall'anestesia in fretta e riprendere la normale funzione in pochi minuti. Prestare la debita attenzione ai topi che presentano sintomi anomali, come ad esempio un eccessivo sanguinamento dal sito di iniezione, come l'eutanasia degli animali può essere appropriato. Una corretta gestione degli animali ⁶ e aderenza al National Institutes of Health e cura degli animali e le linee guida istituzionali Comitato uso devono essere seguite.

2. Brain-infiltrazione dei leucociti preparazione delle cellule:

1. Preparare a fondo rotondo provette Oak Ridge che può contenere una capacità di 30 ml con 10 ml di RPMI 1640, 9 ml di Percoll e 1 ml di PBS 10X e tubi dovrebbero sedersi a temperatura ambiente in panchina durante il processo di rimozione del cervello.
2. Portare Ficoll-Paque Plus per temperatura ambiente (RT).
3. Eutanasia animale modificato isoflurano overdose ⁵ e rimuovere rapidamente il cervello utilizzando un tessuto in acciaio inox spatola e mettere in un tubo da 15 ml contenente 5 ml RPMI sul ghiaccio. In alcune circostanze, PBS-perfusione può essere opportuno eliminare le cellule circolanti nel sangue periferico dalla preparazione Bils. I topi devono essere adeguatamente e completamente anestetizzato prima di PBS-perfusione.
4. Trasferimento del cervello e la soluzione RPMI da ml 7 di vetro Pyrex tessuto marchio Tenbroeck smerigliatrice e delicatamente omogeneizzare con 10-15 colpi.
5. Pipettare altri 5 ml in RPMI l'omogeneizzatore e pipetta su e giù due volte. Trasferimento cervello omogenato (circa 10 ml) per precedentemente preparato a fondo rotondo tubo e capovolgere delicatamente 2-3 volte per mescolare.
6. Spin omogenato cerebrale _ave a 7800g per 30 min a RT in un angolo fisso F0360 in un rotore Beckman Allegra X-22R centrifuga clinica.
7. Dopo la centrifugazione, rimuovere i detriti della mielina che ha galleggiato alla parte superiore del gradiente. Raccogliere lo strato di leucociti che fluttua sopra il pellet di cellule rosse del sangue (Figura 2).
8. Ceppo strato di leucociti attraverso un filtro a 40 micron di cellule in un 50 ml conica. Portare soluzione a 50 ml di volume con RMPI.
9. Spin tubi contenenti sospensione diluita di cellule in una centrifuga clinica a 1500 rpm (600g _ave) per 5 minuti a temperatura ambiente.
10. Aspirare il supernatante e raccogliere il pellet di cellule. Risospendere il pellet in 1 ml di FACS tampone (1% di sieroalbumina bovina, sodio azide 0,02% di calcio e magnesio senza PBS) e trasferire la sospensione cellulare a 5 ml tubi fondo rotondo FACS.
11. Attenzione alla base della sospensione con 1 ml di Ficoll-Paque Plus.
12. In provetta a 2500 giri al minuto (1400 diede) in centrifuga clinica per 25 minuti a temperatura ambiente, senza freno.
13. Rimuovere bianco, strato soffice a livello di interfaccia (Figura 2) con la pipetta da 1 ml e trasferimento al nuovo 5 ml di tubo di FACS. Lavare cells con 4 ml di tampone FACS.
14. Rotazione del tubo a 1500 rpm (600g _ave) per 5 min a RT in centrifuga clinica alle cellule pellet.
15. Aspirare il surnatante e raccogliere pellet cellulare. Risospendere il pellet di leucociti nel tampone appropriato e tenere sul ghiaccio in nuovi tubi FACS.
16. Contare le celle, valutare la vitalità cellulare per esclusione Blu tripano e analizzare mediante citometria a flusso. In generale, gli investigatori si può aspettare di acquisire circa 5 x 10 ⁵ cellule / animale.

3. Citometria a flusso immunofenotipo

1. Dopo aver isolato e il conteggio dei leucociti, le cellule rotazione per 3 minuti a 1500 rpm (600 _ha) in una centrifuga clinica.
2. Risospendere il pellet in tampone bloccante contenente quanto segue: buffer di FACS, sopranatante 2.4G2 ibridoma (Fc block; anti-CD16/32) e siero fetale bovino con un rapporto di 10:05:01 e incubare per 30 minuti a 4 ° C .
3. Preparare e aggiungere anticorpi coniugati contro gli antigeni extracellulari alle cellule bloccate ad una concentrazione di 1:200 e incubare per 30 minuti a 4 ° C al buio. Macchia e incubare cellule in 200 microlitri di una 96-e V-piastra inferiore. Controlli appropriati includono le cellule senza macchia e campioni di compensazione fluorocromo, se necessario.
4. Gira la cellule colorate a temperatura ambiente per 3 minuti a 1500 rpm (600 _ha) in una centrifuga clinica utilizzando un appropriato rotore per piastre da 96 pozzetti.
5. Aspirare il surnatante e lavare le cellule con 200 microlitri di buffer FACS pipettando gentilmente su e giù per 3 volte.
6. Ripetere la tecnica di lavaggio sopra due volte.
7. Dopo il lavaggio, risospendere le cellule nel 2% paraformaldeide e trasferimento in tubi di FACS. Fissaggio è necessario per citometria a flusso delle cellule infette del livello di biosicurezza 2 reagenti.
8. Eseguire le cellule fissato su un BD FACS Calibur seguendo un metodo di citometria a flusso modificato ⁸ e analizzare i file non in linea con FlowJo, WinMDI o altri software disponibili citometria a flusso di analisi.
9. L'analisi di 50-100.000 eventi per campione è generalmente richiesto per immunofenotipizzazione adeguata.

Gli anticorpi coniugati direttamente utilizzati in questo esperimento:

CD45 è stata rilevata con clone 30-F11. Ly6C / G è stata rilevata con clone Gr1, RB6-8C5. CD11b è stato rilevato con clone M1/70. F4/80 è stata rilevata con clone BM8.

4. Rappresentante dei risultati:

Mostriamo i risultati fenotipizzazione cellulare per Bils del mouse a 24 ore dopo l'infezione (Figura 3). Leucociti sono state colorate con PerCP-coniugato anti-CD45 del mouse per rilevare le cellule immunitarie, PE-coniugato anti-topo Ly6C / G per rilevare monociti infiammatorie, APC-coniugato anti-topo CD11b e APC-coniugato anti-topo F4/80 per rilevare le cellule di lignaggio monociti. L'analisi è stata eseguita con uno strumento BD FACS Calibur.

Figura 1. Localizzazione anatomica del sito di iniezione. Il sito di iniezione si trova 1 millimetro anteriore al bregma e 1 mm laterale per la sutura sagittale sul lato destro.

Figura 2. Leucociti illustrazione di separazione gradiente di leucociti e Bils. Sono inizialmente raccolti direttamente sotto il livello detriti mielina e sopra il pellet RBC nel gradiente Percoll. Il bianco, strato soffice (Bils) presso l'interfaccia è raccolto dal gradiente di Ficoll.

Figura 3. Immunofenotipo del cervello infilatrating leucociti a 24 ore dopo l'infezione. Leucociti del mouse sono stati isolati dal cervello per centrifugazione differenziale densità del tessuto omogenato preparati con gli animali a 24 ore dopo l'infezione intracranica. Le cellule sono state colorate con anticorpi coniugati contro la fluorescenza-topo CD45, Ly6C / G, CD11b e F4/80. Gating iniziale è stata eseguita tracciando CD45, un marker per le cellule immunitarie, contro la dispersione in avanti (FSC), un indicatore della dimensione della cella (C). ^L'hi CD45 (A, D), ^lo CD45 (B, E), e CD45 ^neg (F, G), le popolazioni sono stati poi analizzati per i livelli di espressione relativa dei marcatori di monociti e macrofagi Ly6C / G, F4/80 (A, B , F), e CD11b (D, E, G). Ly6C / G ^{+ +} CD11b F4/80 ⁺ monociti infiammatori sono stati trovati quasi esclusivamente nella popolazione CD45 ^hi (A, D), in linea con l'infiltrazione di queste cellule dalla periferia. Al contrario, ^lo Ly6C/G-F4/80 CD11b ⁺ macrofagi sono stati trovati quasi esclusivamente nel CD45 ^lo (B, E) e CD45 ^neg (G) le popolazioni, coerentemente con un fenotipo residente. In numerosi esperimenti, non abbiamo mai osservato le cellule CD45 ^hi o Ly6C / G ^{+ +} CD11b F4/80 ⁺ monociti infiammatorie nel cervello dei non infetti o sham-infezioniTed topi (dati non riportati).

Noi abitualmente uso di citometria a flusso per determinare sia la qualità della preparazione infiltrazione delle cellule cerebrali, e per distinguere le diverse popolazioni di cellule immunitarie ^{2, 9.} Al acuta intervalli di tempo, il nostro metodo Bils rese elevate percentuali di monociti infiammatorio all'interno della popolazione CD45hi così come alte percentuali di macrofagi nella popolazione CD45lo. Ciò indica che una risposta immunitaria riproducibile all'interno del cervello possono essere robustamente caratterizzato dal nostro metodo.

Questa tecnica è di particolare importanza per gli esperimenti che richiedono una popolazione ben caratterizzato di cellule immunitarie dal cervello di topo. Abbiamo già eseguito esperimenti di trasferimento adottivo, iniettando il nostro cervello infiltrazione dei leucociti in topi host tramite iniezione coda vena ^7, e abbiamo caratterizzato il Bils attraverso vari esperimenti in vitro ^9. La nostra preparazione Bils è particolarmente utile in esperimenti che devono distinguere le diverse popolazioni di cellule immuni da cellule residenti del cervello, tra cui i macrofagi e microglia residente. Un'altra applicazione di interesse comprende real-time RT-PCR effettuata su RNA totale isolato da Bils a 7 giorni dall'infezione di identificare le funzioni effettrici ^3. Per esempio, abbiamo misurato GAPDH, granzima B e perforina RNA in Bils raccolti a 7 giorni dall'infezione da perforina-competente e carenti di animali infetti da TMEV. Abbiamo anche utilizzato il nostro metodo per determinare come Bils NKG2D contribuisce alla compensazione TMEV dal cervello di topi con infezione acuta ^4.

Ci sono diversi aspetti critici del metodo. E 'essenziale portare tutte le soluzioni a temperatura ambiente prima della preparazione per evitare stress inutili alle leucociti e per assicurare una corretta separazione densitometriche. Stress sul leucociti contribuisce alla morte delle cellule, il che li rende particolarmente inaffidabile per esperimenti in vivo, dove vive una popolazione di cellule adoptively è trasferito in un animale ospite. Abbiamo anche stabilito che l'uso di Percoll a freddo non solo cambia la densità del gradiente discontinuo, ma influisce anche sulla qualità dei leucociti. Un altro elemento critico è sufficiente omogeneizzazione e delicata del tessuto cerebrale. Abbiamo scoperto che omogeneizzazione inadeguata e approssimativa dei risultati tessuto cerebrale in quantità abbondante di detriti cellulari visto al microscopio e citometria a flusso. Detriti cellulari possono anche derivare da non sforzare il cervello omogenato con il filtro delle cellule di dimensioni appropriate. La giusta attenzione al dettaglio è fondamentale nella preparazione Bils ampia e sufficiente per la sperimentazione e analisi.