Isolering av Brain-infiltrera leukocyter

1. Intrakraniell virus injektion:

Följande Tekniken har ändrats och används i stor utsträckning av vÃ¥ra labb och kollegor. Kortfattat (1, 10) intrakraniell injektion av Daniels stam av Theiler är murina encefalomyelit virus (TMEV) eller simulerade-infektion utförs pÃ¥ unga möss (helst 5-6 veckors Ã¥lder) för att väcka hjärnan infiltrera leukocyter (BILS). Observera att resultaten kommer att variera mellan Daniels stam och BEAN stam, och GDVII stammen. För skörd BILS, möss fÃ¥r 2x10 ⁵ PFU av TMEV och är smittade i 24 timmar.

1. Fäst injektionsnål (27 gauge, ¼ i, Kendall), en automatisk 1 ml Hamilton spruta och inställd på att leverera 10 ìl av virus.
2. Upprätta TMEV i 10 mikroliter DMEM i sprutan med noggrann uppmärksamhet på luftbubblor. Vid behov bluff infekterade möss får 10 ìl virusfri DMEM.
3. Strax före injektionen, häll ca 1 ml isofluran i en glaskupa som innehåller en tråd rutnät med bomull substrat under.
4. Placera möss direclty på trådgaller i glaskupan tills de blir lätt sövda, okänslig för toe-nypa och immobiliserade av inhalant narkos, ungefär 10-15 sekunder. Möss bör inte komma i direkt kontakt med isofluran, eftersom substansen kan vara irriterande och frätande.
5. Medan under narkos, förbereda möss för injektion genom att snabbt lokalisera lämpliga koordinater i frontala cortex regionen på skallen med rakning och infärgning. Det allmänna läget för injektion är 1 mm främre till bregma och 1 mm i sidled till sagittal sutur på höger sida (Figur 1). Medan stereotaktisk injektion kan vara lämplig för vissa experimentella situationer, har vi funnit att fri hand injektion utan rakning eller infärgning är lämplig för de flesta experimenten. Parting pälsen med nålen punkt längs båda axlarna är lämplig för injektion.
6. För att göra en injektion, orientera nålen vinkelrätt mot skallen och trycker genom benet till ca 3 mm djup.
7. Express viruset in i hjärnan genom att trycka på Hamilton sprutan knappen och vänta 2 sekunder för viruset att komma in i hjärnan innan man tar ut.
8. Ta försiktigt bort nÃ¥len och placera musen i en ren och torr bur. Möss vakna upp ur narkos snabbt och Ã¥tergÃ¥ till normal funktion inom nÃ¥gra minuter. Titta ordentligt pÃ¥ möss som uppvisar onormala symtom sÃ¥som kraftig blödning frÃ¥n injektionsstället, som dödshjälp av djuret kan vara lämpliga. Korrekt djurhantering ⁶ och anslutning till National Institutes of Health and Institutional Animal Care och använda riktlinjer kommittén mÃ¥ste följas.

2. Brain-infiltrera leukocyt cellberedningen:

1. Förbered rundbottnad Oak rör Ridge centrifugen som kan hålla en kapacitet på 30 ml med 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll och 1 ml 10X PBS och rör bör sitta vid RT på bänken under hjärnan borttagningen.
2. Ta Ficoll-Paque Plus till rumstemperatur (RT).
3. Euthanize animaliska modifierad isofluran överdos ⁵ och snabbt ta bort hjärnan med hjälp av en rostfri stekspade stÃ¥l vävnad och placera i ett 15 ml koniskt rör som innehÃ¥ller 5 ml RPMI pÃ¥ is. Under vissa omständigheter kan PBS-perfusion vara lämpligt att ta bort cirkulerande perifera blodceller frÃ¥n BILS förberedelser. Möss ska vara fullständigt och korrekt bedövas före PBS-perfusion.
4. Överföring hjärnan och RPMI lösning till en 7 ml glasflaska Pyrex varumärke Tenbroeck vävnad kvarn och försiktigt homogenisera med 10-15 slag.
5. Pipettera ytterligare 5 ml RPMI i homogeniseringsblandare och pipettera upp och ner två gånger. Överföring hjärnan homogenatet (ca 10 ml) till tidigare förberedda rundbottnad rör och vänd försiktigt 2-3 gånger för att blanda.
6. Spin hjärnan homogenatet på 7800g _Ave i 30 min vid strålbehandling i en F0360 fast-vinkel rotor i en Beckman Allegra X-22R kliniska centrifug.
7. Efter centrifugering, ta bort myelinet skräp som flöt till toppen av övertoningen. Samla leukocyter skikt som flyter ovanpå röda blodkroppar pellet (figur 2).
8. Sila leukocyt lagret genom ett 40 ìm cell sil i en 50 ml konisk. Lösningen upp till 50 ml volym med rmpi.
9. Spin rör som innehåller utspädd cellsuspension i en klinisk centrifugera vid 1500 rpm (600 g _ave) i 5 min vid RT.
10. Aspirera supernatanten och samla cellpelleten. Suspendera pelleten i 1 ml FACS Buffer (1% bovint serumalbumin, 0,02% natriumazid på kalcium och magnesium-fri PBS) och överför cellsuspensionen till 5 botten ml runda FACS rör.
11. Noggrant underlag fjädring med 1 ml Ficoll-Paque Plus.
12. Spin rör vid 2500 rpm (1400 gav) i kliniska centrifugera i 25 minuter vid RT utan broms.
13. Ta bort vitt, fluffigt lager i gränssnittet (Figur 2) med 1 ml pipett och för över till nya 5 ml FACS rör. Tvätta Calnar med 4 ml FACS buffert.
14. Spin rör vid 1500 rpm (600 g _ave) i 5 min vid RT i kliniska centrifug till pellets celler.
15. Aspirera supernatanten och samla cellpelleten. Resuspendera leukocyter pelleten i lämplig buffert och hålla på is i nya FACS röret.
16. Räkna celler, bedöma cellviabiliteten av Trypan blÃ¥ utslagning och analysera med flödescytometri. I allmänhet kan utredarna räkna med att fÃ¥ ungefär 5 x 10 ⁵ celler / djur.

3. Flödescytometrisk immunofenotypning

1. Efter att isolera och räkna leukocyter, snurra cellerna i 3 minuter vid 1500 rpm (600 _gav) i en klinisk centrifug.
2. Återsuspendera pelleten i blockerande buffert som innehåller följande: FACS buffert, supernatanten från 2.4G2 Hybridomteknik (Fc block; anti-CD16/32) och fetalt bovinserum i förhållandet 10:05:01 och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C .
3. Förbered och lägg konjugerade antikroppar mot extracellulära antigener till de blockerade cellerna vid en koncentration av 1:200 och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C i mörker. Fläcken och inkubera celler i 200 l av en 96-brunnars V-bottenplatta. Lämpliga kontroller inkluderar ofärgade celler och fluorokrom prover ersättning, om det behövs.
4. Snurra färgade celler vid RT i 3 minuter vid 1500 rpm (600 _gav) i en klinisk centrifug med hjälp av en rotor lämplig för plattor med 96 brunnar.
5. Aspirera supernatanten och tvätta cellerna med 200 l FACS buffert genom att försiktigt pipettera upp och ned tre gånger.
6. Upprepa ovanstående tvätt tekniken två gånger.
7. Efter tvättning, resuspendera cellerna i 2% paraformaldehyd och transfer till FACS rör. Fixering krävs för flödescytometrisk analys av celler infekterade av biosäkerhetsnivå 2 reagenser.
8. Kör den fasta celler pÃ¥ en BD FACS Calibur efter en modifierad flödescytometri metod ⁸ och analysera filer offline med hjälp FlowJo, WinMDI eller andra tillgängliga flödescytometri analysprogram.
9. Analysen av 50-100,000 händelser per prov krävs i allmänhet för tillräcklig immunfenotypning.

Direkt konjugerade antikroppar som används i detta experiment:

CD45 upptäcktes med klon 30-F11. Ly6C / G upptäcktes med klon Gr1, RB6-8C5. CD11b upptäcktes med klon M1/70. F4/80 upptäcktes med klon BM8.

4. Representativa resultat:

Vi visar resultat cell fenotypning för mus BILS 24 timmar efter infektion (figur 3). Leukocyter färgades med PerCP-konjugerat anti-mus CD45 för att upptäcka immunceller, PE-konjugerat anti-mus Ly6C / G för att upptäcka inflammatoriska monocyter, APC-konjugerat anti-mus CD11b och APC-konjugerat anti-mus F4/80 att upptäcka celler av monocyter härstamning. Analysen utfördes med en BD FACS Calibur instrument.

Figur 1. Anatomiska lokalisering av injektionsstället. Injektionsstället ligger 1 mm främre till bregma och 1 mm i sidled till sagittal sutur på höger sida.

Figur 2. Illustration av lutning separering av leukocyter och BILS. Leukocyter initialt samlas direkt under myelinet skräp lager och ovanför RBC pellets i Percoll lutning. Den vita, fluffiga lager (BILS) i gränssnittet samlas in från Ficoll lutning.

Figur 3. Immunofenotyp av brain-infilatrating leukocyter vid 24 tim efter infektion. Mouse leukocyter var isolerade frÃ¥n hjärnan genom differential täthet centrifugering av vävnad homogenat framställda av djur pÃ¥ 24 tim efter intrakraniell infektion. Cellerna färgades med fluorescerande-konjugerade antikroppar mot mus CD45, Ly6C / G, CD11b och F4/80. Inledande gating utfördes genom att rita CD45, en markör för immunceller mot Forward Scatter (FSC), en indikator pÃ¥ cellens storlek (C). CD45 ^hej (A, D), CD45 ^lo (B, E) och CD45 ^neg (F, G) populationer har sedan analyserats för relativa uttryck nivÃ¥er av monocyter och makrofager markörer Ly6C / G, F4/80 (A, B , F) och CD11b (D, E, G). Ly6C / G ⁺ F4/80 ⁺ CD11b ⁺ inflammatoriska monocyter pÃ¥träffades nästan uteslutande i CD45 ^hi befolkningen (A, D), i linje med infiltration av dessa celler frÃ¥n periferin. Däremot var Ly6C/G-F4/80 ^lo CD11b ⁺ makrofager finns nästan uteslutande i de CD45 ^lo (B, E) och CD45 ^neg (G) populationer, i överensstämmelse med en invÃ¥nare fenotyp. I mÃ¥nga experiment har vi observerade aldrig CD45 ^hi celler eller Ly6C / G ⁺ F4/80 ⁺ CD11b ⁺ inflammatoriska monocyter i hjärnan hos infekterade eller simulerade-infektionTed möss (data visas inte).

Vi använder rutinmässigt flödescytometri för att avgöra både kvaliteten av hjärnan infiltrera cellberedningen och för att skilja olika populationer av immunceller ^{2, 9.} Vid akuta gånger, ger våra BILS metod hög andel av inflammatoriska monocyter inom CD45hi befolkningen samt hög andel av makrofager i CD45lo befolkningen. Detta tyder på att ett reproducerbart immunsvar i hjärnan kraftigt kan präglas av vår metod.

Denna teknik är av särskild betydelse för experiment som kräver en väldefinierad population av immunceller från musen hjärnan. Vi har tidigare utfört adoptiv transfer experiment genom att injicera vår hjärna infiltrerande leukocyter i värd möss via svansvenen injektion ^7, och vi har präglat BILS via olika in vitro-försök ^9. Vår BILS beredning är särskilt fördelaktig i experiment som måste skilja på olika populationer av immunceller från inhemska celler i hjärnan, inklusive bosatt makrofager och mikroglia. En annan tillämpning av intresse inkluderar realtids-RT-PCR analysen utföras på totalt RNA isoleras från BILS vid 7 dagar efter infektion för att identifiera effektorfunktioner ^3. Till exempel mätte vi GAPDH, granzyme B och perforin RNA i BILS samlas vid 7 dagar efter infektion från perforin-kompetent och-brist djur infekterade med TMEV. Vi har också utnyttjat våra BILS metod för att avgöra hur NKG2D bidrar till att rensa TMEV från hjärnan av akut infekterade möss ^4.

Det finns flera kritiska aspekter av metoden. Det är viktigt att få alla lösningar till rumstemperatur före beredning för att undvika onödig stress på leukocyter och för att säkerställa korrekt densitometriska separation. Stress på leukocyter bidrar till celldöd, vilket gör dem särskilt opålitliga för in vivo-experiment där en levande population av celler adoptively överförs till ett värddjur. Vi har också fastställt att användningen av kalla Percoll inte bara förändringar i densitet diskontinuerliga lutning, men påverkar också kvaliteten på leukocyter. En annan central faktor är tillräcklig och skonsam homogenisering av hjärnvävnad. Vi har funnit att bristfällig och grov homogenisering av resultat hjärnvävnad i kopiösa mängder av cellfragment ses av mikroskopi och flödescytometri. Cellfragment kan också uppstå av att inte anstränga hjärnan homogenatet med lämplig storlek cellen sil. Korrekt uppmärksamhet på detaljer är nyckeln för att förbereda god och tillräcklig BILS för vidare experimenterande och analys.