JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Bioengineering

محوار النمو الإمتداد : إن Mechanotransduction من نمو الخلايا العصبية

1,2, 1,2, 1

1Departments of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 2Graduate School of Biomedical Sciences, University of Medicine and Dentistry of New Jersey

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    ووضعت هندسة الأنسجة طريقة فريدة لإطالة العديد من الألياف العصبية في الثقافة التي تلخص محوار نمو تمتد ؛ نموذج للنمو الجهاز العصبي حيث الأعصاب استطال بالتزامن مع نمو الجسم توسيع.

    Date Published: 8/10/2011, Issue 54; doi: 10.3791/2753

    Cite this Article

    Loverde, J. R., Tolentino, R. E., Pfister, B. J. Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth. J. Vis. Exp. (54), e2753, doi:10.3791/2753 (2011).

    Abstract

    خلال مرحلة ما قبل متشابك التطور الجنيني ، والعمليات العصبية اجتياز مسافات قصيرة للوصول إلى أهدافها عن طريق مخروط النمو. بمرور الوقت ، يتم فصل الخلايا العصبية من محطات somata محوار ، نظرا لنمو الهيكل العظمي للكائن توسيع (فايس 1941 ؛ رمادي ، Hukkanen وآخرون 1992). هذا يؤدي الى وضع mechanotransduction الثانوية للنمو الخلايا العصبية قادرة على استيعاب استطالة المستمر للمحوار (براي 1984 ؛ هايدمان وBuxbaum 1994 ؛ هايدمان ، لامورو وآخرون 1995 ؛. فيستر ايواتا وآخرون 2004).

    محوار النمو الإمتداد (ASG) هو تصور عاملا أساسيا في نضج العمليات الجنينية قصيرة في الأعصاب طويلة ومساحات المادة البيضاء من سمات النظام العصبي البالغين. الأمين العام المساعد للدراسة في المختبر ، ونحن تصميم المفاعلات الحيوية لتطبيق التوتر على العمليات محواري قصيرة من الثقافات العصبية (Loverde ، Ozoka وآخرون 2011). هنا ، ونحن بالتفصيل الأساليب التي نستخدمها لإعداد المفاعلات الحيوية والسلوك أمين عام مساعد. أولا ، في كل حارة تمتد من مفاعل حيوي ، ومطلي الخلايا العصبية عند الركيزة a القطر الصغير التلاعب بها. المقبل ، تجديد الخلايا العصبية محواري عملياتها ، عبر تمديد مخروط النمو ، وعلى ركيزة ثابتة. أخيرا ، يتم تنفيذ النمو التي تمتد سحب جثث مطلي الخلية بعيدا عن محطات محوار انضمت إلى الركيزة الثابتة ؛ تلخص نمو الهيكل العظمي بعد التمديد مخروط النمو.

    وقد أظهرت الأعمال السابقة أن جماعة أبو سياف من الفئران الجنينية الخلايا العصبية الظهرية العقد الجذرية القادرة على معدلات نمو غير مسبوقة تصل إلى 10mm/day ، حيث بلغت أطوال تصل إلى 10cm ، في حين أدى في الوقت نفسه زيادة في أقطار محواري (سميث وولف وآخرون 2001 ؛. فيستر ايواتا وآخرون 2004 ؛. فيستر Bonislawski وآخرون 2006 ؛. فيستر ايواتا وآخرون 2006 ؛ سميث 2009). هذا في تناقض مثير للتمديد مخروط النمو التجديدي (في غياب المحفزات الميكانيكية) حيث متوسط ​​معدلات النمو 1mm/day مع التجديد الناجحة تقتصر على أطوال أقل من 3cm (فو وغوردون 1997 ؛. فيستر ، غوردون وآخرون 2011). وبالتالي يجوز إجراء مزيد من الدراسة لكشف الأمين العام المساعد مساعدة الآليات التي تحد من نمو dysregulated التجدد في ظل غياب المحفزات الميكانيكية.

    Protocol

    1. نظرة عامة على نظام تمدد أكسون تفاعلات الاحيائية النمو

    1. وقد استخدمت نهجين الغالبة على تطبيق قوات التجريبية لخلايا عصبية. في المقاربة الأولى ، يتم تطبيق قوات إلى الخلايا العصبية بأكملها (لو ، Franze وآخرون 2006 ؛. شيتا ، كاي وآخرون 2010 ؛. يندكفيست ، ليو وآخرون 2010). في النهج الثاني ، وتطبق القوات مباشرة إلى محور عصبي من خلال سحب على مخروط النمو. استخدام الإبر والزجاج ، وقد استخدم هذا النهج الأخير لتشكيل نموذج جديد محوار (برنال ، Pullarkat وآخرون 2007 ؛. أوتول ، لامورو وآخرون 2008 ؛. امورو ، هايدمان وآخرون 2010) ، لتحديد عتبات قوة للاستطالة وتراجع (Dennerll ، لامورو وآخرون 1989 ؛. تشنغ لامورو وآخرون 1991 ؛. امورو ، تشنغ وآخرون 1992) ، وتجميع وتحليل العصبي في محطات محوار (Siechen يانغ وآخرون 2009). ووضعت هندسة الأنسجة فريد تمديد هذه الطريقة لإنتاج العصبية الكبيرة بنيات باستخدام الإمتداد أكسون الآلي النمو (ASG) مفاعل حيوي النظام (ايواتا ، براون وآخرون 2006 ؛. فيستر ايواتا وآخرون 2006). مؤخرا ، قمنا بتطوير نسخة مصغرة من نظام مفاعل حيوي لدراسة الأمين العام المساعد المجهر في الوقت الحقيقي (Loverde ، Ozoka آخرون 2011). هنا ، ونحن بالتفصيل بروتوكول 9 ايام (الجدول 1) التي نستخدمها حاليا على إعداد وتنفيذ جماعة أبو سياف المفاعلات الحيوية بشكل روتيني.
    2. عموما العملية : ويتكون هذا النظام من مفاعل حيوي جماعة أبو سياف ثلاثة عناصر رئيسية هي : 1) غرفة مستقلة مع ممرات مفاعل حيوي (الآبار ممدود) حيث يتم استزراع الخلايا العصبية وتمتد ، 2) والجدول الآلي الحركة الخطية لتطبيق القوات تمتد 3) ومحرك الخطوة محرك وحدة تحكم مع برنامج للسيطرة على نمو تمتد (الشكل 1).
    3. باختصار ، تم إجراء تصنيع نماذج مفاعل حيوي في متجر للآلة باستخدام آلة طحن العمودي (بريدجبورت ، الميرا ، نيويورك). للتوافق مع الحياة ، وسهولة التعقيم ، وقوة التحمل ، وتشكيله المكونات الداخلية من مفاعل حيوي polyetheretherketone 3 / 8 "(نظرة خاطفة). شفاف البولي كان يستخدم لأغطية للسماح المجهر الضوئي وعرض الثقافات. مقاومة للتآكل الفولاذ المقاوم للصدأ المسامير 316 و الأجهزة كاملة التجميع (ماكماستر ، كار ، إلمهورست ، IL).
    4. وتتألف الغرفة من مفاعل حيوي إطار تمتد التي تشكل 3 حارات ، وهو قابل للتعديل كتلة السحب التي تعالج الخلايا عبر الممرات ، وسحب قضبان جاحظ للتلاعب الخارجية (الشكل 2). ومطلي الثقافات العصبية على المتاح Aclar ركائز الثقافة تقطر بدعم من كتلة القطر (أرقام 2 و 3). والركيزة الثابتة ساترة المتاح يعلقها على الجزء السفلي من الإطار يمتد ويمتد كل الممرات 3. قبل أن تمتد ، ويجب أن الخلايا العصبية مطلي توسيع عمليات محواري من الركيزة تقطر على الركيزة الثابتة عبر تمديد مخروط النمو. سكان المحاور التي من شأنها سد ركائز سيخضع في وقت لاحق تمتد من النزوح من السيطرة على كتلة السحب.
    5. الجدول الآلي الحركة الخطية تتألف من السيارات السائر (HT23 - 397 ، منتجات موشن التطبيقية ، اتسونفيل ، كاليفورنيا) والجدول الخطية الحركة (MIPS - 2 - 10 - 1.0mm ، أنظمة هيدروليك ، Monteville ، ونيو جيرسي) لنصرة جدول المحاذاة delrin . يجلس في غرفة مفاعل حيوي داخل الجدول موازية لطاولة الحركة الخطية. يتم تثبيتها على قضبان السحب تمتد من غرفة إلى طاولة مفاعل حيوي الحركة الخطية باستخدام محول.
    6. مبرمجة محرك السيارات تحكم الخطوة (سي عام 2035 ، منتجات موشن التطبيقية) باستخدام مبرمج سي شملت برامج للسيطرة على التلاعب ركائز القطر. يتم تطبيق تمتد محواري بطريقة تدريجية من خلال اتخاذ سلسلة من الخطوات الصغيرة متباعدة التشريد التي يسكن مرات (فيستر ايواتا وآخرون 2004 ؛. فيستر ايواتا وآخرون 2006). هذا نظام الكمبيوتر التي تسيطر عليها يوفر القدرة على ملامح برنامج مخصص لجماعة أبو سياف ، وضروري للتجريب المستمر على مدى عدة أيام إلى أسابيع.

    2. إعداد غرفة تفاعلات الاحيائية

    1. إعداد المتاح ركائز ثقافة القطر وثابتة للثقافة العصبية :
      1. يتم قطع ركائز الثقافة تقطر من 8.5 "× 11" ورقة من فيلم Aclar (33C 2.0 مل ، دقق الهيكل والغرب تشيستر ، والسلطة الفلسطينية). باستخدام شفرة حادة لقطع ركائز حوالي 0.5 خ 2.5cm ، أو أقصر قليلا من عرض الممرات للسماح على الأقل 1 - 2mm والتخليص على كلا الجانبين.
      2. الرمال برفق خفض 03/01 الثالثة من ركائز الثقافة تقطر على الجانبين باستخدام غرامة 1200 حصى ورق زجاج (ماكماستر كار). الرملي من ركائز تقطر يسهل نمو محاور عصبية من ركائز تقطر على الركيزة الثابتة ساترة.
      3. قطع 5 × 7cm قطعة من Aclar أو استخدام زجاج ساترة رقم 1 ليكون بمثابة ركيزة ثابتة (# 4865-1 ، مختبرات أبحاث الدماغ ، نيوتن ، ماجستير).
      4. تنظيف الركائز الثقافة ه بمحلول مخفف Alconox وشطف جيدا مع 2 المنقى O. درهم
      5. تعقيم ركائز الثقافة عن طريق الانغماس في الإيثانول 70 ٪ لمدة 30 دقيقة. السماح لركائز الهواء الجاف داخل غطاء نسيج الثقافة العقيمة.
    2. تنظيف غرفة مفاعل حيوي مع Alconox تمييع وتعقيم الأوتوكلاف داخل حاوية الأوتوكلاف. مباشرة بعد التعقيم ، ونقل إلى غطاء العقيمة والسماح الهواء الجاف.
    3. استمرار داخل الغراء العقيمة ، يميل هود ركائز الثقافة في مفاعل حيوي باستخدام السيليكون RTV (داو كورننغ # 732 ، ماكماستر كار) ومسحات القطن المعقم (ماكماستر كار) :
      1. مع الساقين كتلة السحب في موقعها تستقيم الكاملة ، الغراء الثقافة تقطر ركائز في الساقين كتلة السحب في الجزء غير غطى بالرمل. تجنب ملامسة سطح الثقافة غطى بالرمل.
      2. الغراء الركيزة ثقافة ثابتة في الجزء السفلي من الغرفة مفاعل حيوي.
      3. إزالة الغراء الزائد وجيوب الهواء بالضغط بلطف مسحة جافة ضد ركائز لصقها.
      4. منذ حمض الخليك RTV سيليكون الترشيح التي هي سامة لخلايا عصبية ، يتم ترك مفاعل حيوي لتجف تحت أشعة فوق البنفسجية داخل غطاء لمدة 2 أيام كاملة قبل عرضه الثقافات العصبية.
    4. انخفاض الساقين كتلة القطر لتحقيق التداخل بين 2 - 3mm نصائح من ركائز تقطر غطى بالرمل والركيزة الثابتة. ويجب إيلاء اهتمام حاسم لحجم التداخل ، إذا كانت كبيرة جدا ، ونصائح من ركائز القطر قد يصرف الخروج من ركيزة ثابتة ، وتخفيض عدد المحاور التي تمتد التداخل (الشكل 3).
    5. موقف كتلة القطر في نقطة الانطلاق ، مع سحب قضبان داخل مفاعل حيوي تراجع. تضييق الخناق الشلل لمنع الحركة من قضبان السحب قبل أن تمتد النمو.

    3. العصبية الثقافات

    1. 1mL بركة من 10 ميكروغرام / مل عالية الوزن الجزيئي البولي د يسين (القط # 354210 دينار بحريني ، بيدفورد ، ماجستير) في مصل الدم خالية من وسائل الاعلام في المنطقة الركيزة اجهة كل حارة. يسمح الحل التمسك دون عائق لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. شطف 3X بلطف مع DH 2 O ، تليها شطف النهائي مع وسائل الاعلام الثقافة. يجب أن يتم تنفيذ Pipetting في الجزء الخلفي من الممرات والأبعد واجهة الركيزة.
    2. عزل الظهرية explants العقد الجذر (DRGs) من الفئران E16 الجرو. باستخدام stereomicroscope ، تمييع explants إلى قطرات باستخدام أطباق بتري. جمع explants 3-4 باستخدام ماصة 100 ميكرولتر وطبق على حافة الركيزة ثقافة القطر غطى بالرمل. ويجب الحرص على لوحة للexplants على حافة الركيزة تقطر به بركة صغيرة من وسائل الإعلام. حتى وسائل الإعلام 1mL الثقافة في حارة غير كافية لمنع التبخر لعدة ساعات في الوقت الذي تحد من حركة explants. وسائل الاعلام صياغة : Neurobasal مع B - 27 L - + 0.5mM الجلوتامين (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا) ، 1 ٪ FBS - مرحبا (Hyclone ، التايم ، ماجستير) ، 2.5G / L - D الجلوكوز (G - 7528 ، سيغما ، وسانت لويس ، MO) ، 20ng/mL NGF (13290-010 ، Invitrogen) و 20 ميكرومتر FDU + 20 ميكرومتر مثبطات الإنقسامية يوريدين (F - 0503 ، U - 3003 ، سيغما).
    3. نعلق غطاء ونقل مفاعل حيوي لحاضنة لمدة 1 ساعة أو حتى الخلايا الالتزام.
    4. ملء مفاعل حيوي مع وسائل الاعلام الثقافة في ابعد نقطة في explants لتجنب dislodgment. احتضان مفاعل حيوي لمدة لا تقل عن 5 أيام في حين أن الخلايا العصبية توسيع عمليات محواري على الركيزة الثابتة.

    4. محوار تمدد النمو

    1. ويخضع مفاعل حيوي إجراءات إعداد النهائي داخل غطاء العقيمة :
      1. ملء الخزانات داخل مفاعل حيوي مع الفوسفات مخزنة المالحة لترطيب الغرفة والتبخر الحد من وسائل الإعلام الثقافة. في نظامنا ، والجدران الضميمة تجويف بمثابة الخزانات. بدلا من ذلك ، قد يتم وضع الأغطية طبق بتري الصغيرة على جانبي كتلة السحب فوق الممرات الثقافة.
      2. استبدال وسائل الإعلام والثقافة ، وملء الممرات إلى القدرات. يجب أن يتم تنفيذ Pipetting في الجزء الخلفي من الممرات والأبعد واجهة الركيزة.
    2. مقعد مفاعل حيوي داخل الجدول الحركة الخطية الآلي. إذا كانت التجربة هي ليتم تشغيلها ضمن حاضنة ، ويجب أن لا يكون نتيجة لترطيب التآكل المحتمل للجدول الحركة الخطية الآلي.
    3. ربط محول قضيب القطر للقضبان السحب.
    4. سي باستخدام البرمجيات مبرمج هرول مرحلة الجدول الحركة الخطية لمحاذاة مع محول ربط قضيب القطر وعلى خشبة المسرح. تسهيلا للعمل ، وإعداد تسلسل مبرمج سي مقدما من أجل التلاعب في مرحلة بزيادات محددة.
    5. تخفيف الخناق على تجميد غرفة مفاعل حيوي للسماح بحرية الحركة للكتلة السحب.
    6. يتم تطبيق تمتد بطريقة تدريجية من خلال الشروع في سلسلة من الخطوات الصغيرة متباعدة التشريد التي يسكن مرات (فيستر ايواتا وآخرون 2006). نموذج لدينا يبدأ من خلال اتخاذ خطوات 2 ميكرومتر كل ثانية 172 ،مما أدى إلى امتداد 1MM الصافية أكثر من 24 ساعة. بعد يوم واحد ، يمكن أن يكون معدل التمدد رفعت عن طريق زيادة أو خفض التشريد يسكن الوقت (الجدول 2).
    7. بمجرد بدأ أمين عام مساعد ، وعادة ما تكون التغييرات وسائل الاعلام غير مطلوبة. بمرور الوقت ، ومع ذلك ، والثقافة وسائل الإعلام عموما الحمضية ويتحول هو واضح من خلال التغيير في اللون الأصفر. إذا كان المطلوب مزيد من التجارب ، لم يتم سائل الإعلام القديمة استنزفت تماما ، ولكن بدلا من ذلك تغيرت جزئيا فقط من أجل تقليل الصدمة على المحاور العائمة.

    5. ممثل النتائج :

    ويمكن لعمليات محواري الخضوع السريع بشكل ملحوظ ونمو قوي للامتداد. في البداية ، وتبدأ العملية فترة تمتد بطيئة (≤ 1mm/day) التي تتكون من التشريد صغيرة نادرة. في غضون ال 24 ساعة الأولى من الشد ، mechanotransduction مسارات نمو الخلايا العصبية يحدث ، حيث تبدأ الخلايا العصبية بالإضافة إلى اسطوانة محور عصبي. في غضون 24 ساعة من جماعة أبو سياف مستمرة ، محاور عصبية تظهر زيادة التسامح لتشريد أكبر وأكثر تكرارا. عموما ، يمكن أن تصمد أمام المحاوير زيادة في معدل تمتد لساعات كل 1mm/day 12-24 (فيستر ايواتا وآخرون 2004 ؛. فيستر Bonislawski وآخرون 2006 ؛. فيستر ايواتا وآخرون 2006). زيادة معدل تمتد قريبا جدا ، ومع ذلك ، قد يؤدي إلى المزيد من النمو السريع لتحديد المحاور ولكن سوف يؤدي أيضا إلى انسداد المرضية التي تسبب انقطاع.

    امتداد محاور النمو لديهم ميل إلى شكل رزم ، تشبه بنية كراسات. الاستفادة من البروتوكولات الحالية ، ، وتمتد وسط جزء من حزم نمت محوار لا التصاقات على ركيزة الثقافة. فقط التزمت في البداية ، القريبة والبعيدة قطاعات تمتد من محاور النمو لا تزال تعلق على ركائز الثقافة. تبعا لذلك ، فإن الجزء المركزي من امتداد المحاور نمت تطفو بحرية ، وحساسة للاضطراب بسبب المناولة.

    لمجموعة متنوعة من الأسباب ، يمكن لبعض المحاور لا ينمو بمعدل تمتد التطبيقية. على سبيل المثال ، مع الخلايا العصبية DRG عمليتين محواري ، وكلاهما يمر تمتد ، قد لا يكون قادرا على ترجمة ما يكفي من البروتين وتنمو بمعدل تمتد التطبيقية. سوف المحاور التي لا يمكن استيعاب تمتد رقيقة تطبيق التأثير التالي بواسون. وسوف تمتد لاحقة تؤدي الى انسداد في المحاور ، والتجمع ، تثبيط ، مما أدى إلى انقطاع المرضية. غالبية محاور عصبية ، ولكن ، قادرين على الخضوع لجماعة أبو سياف بنجاح ونسبة صغيرة فقط من الخضوع لهذه العملية المحاور مثل التقليم.

    الشكل 1
    الشكل 1. أكسون تفاعلات الاحيائية النمو النظام الإمتداد : (أ) غرفة الثقافة تفاعلات الاحيائية والجدول الآلي الحركة الخطية ، (B) برمجة سي الخطوة محرك الأقراص التحكم والبرمجيات.

    الشكل 2
    الرقم الثقافة تفاعلات الاحيائية 2. الوصاية. هذا الكاريكاتير يصور غرفة مفاعل حيوي من اعلى مع غطاء إزالتها. موقف كتلة السحب تعكس مرحلة نهاية النمو امتداد محور عصبي. ويمكن ملاحظة امتداد المحاور التي تزرع في حزم داخل الممرات الثقافة.

    الشكل 3
    الشكل 3. اجهة الثقافة التصفيحات الركيزة. هذا الكاريكاتير يصور مكونات آلية سحب داخل كل حارة من مفاعل حيوي من جانبيا. (الأعلى) التداخل الصحيح للركائز ثقافة القطر وثابتة. (القاع) التداخل المفرط للركائز ثابتة القطر وأسباب غيض من الركيزة لسحب حليقة.

    الفيلم 1. مرفق من ركائز الثقافة لغرفة تفاعلات الاحيائية. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو

    الفيلم 2. التصفيحات من DRG Explants على ركائز القطر. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو

    فيلم 3. SiProgrammer الاستخدام. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو

    الفيلم 4. النمو ملحق المخروط على الركيزة الثابتة. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو

    الفيلم 5. أكسون النمو تمدد. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو

    يوم خطوة
    1 التعقيم والتجفيف
    2 لصق وتجميع
    4 متعلق بالخلايا العصبية والطلاء التصفيحات الثقافة
    9 تمتد النمو ابدأ

    الجدول الجدول التجربة 1.

    الوقت [ساعة] قيم تمتد [مم / يوم] يسكن الوقت [ق] مجموع طول [مم] مجموع تمدد الزمن [يوما]
    ادعاء 24 1 172.8 0 1
    تمدد 24 1 172.8 1 2
    تمدد 24 2 86.4 3 3
    تمدد 24 3 57.6 6 4
    تمدد 24 4 43.2 10 5
    تمدد 24 5 34.6 15 6

    الجدول 2 معدل تمدد. جدولة. جميع الخطوات هي امتداد 2 ميكرومتر في النزوح (10 = الخطوة خطوات المحرك تمتد ميكرون 2).

    Discussion

    ينبغي التقيد خطوتين حرجة خلال إعداد المفاعلات الحيوية. أولا ، هناك حاجة إلى وجود تداخل في واجهة مثالية لضمان الركيزة محاور عصبية يمكن أن يعبر على الركيزة الثابتة. وينبغي أن Aclar كرة لولبية بشكل مفرط أو غير ذلك الكمال لا يمكن استخدامها (الشكل 3). لتحسين التداخل ، تأكيد أن يتم غطى بالرمل الركيزة القطر بالتساوي والاتصالات الركيزة الثابتة بشكل موحد على مدى التصحيح 2 - 3mm الاتصال طويلة. وينبغي أن يكون الأمثل للتداخل قبل كل تجربة من خلال تعديل بعناية ارتفاع الساقين القطر.

    الثانية ، في حين ينص على مرفق من الخلايا العصبية ، والطلاء الركيزة دعم قوات كبيرة sheering الناجمة عن النزوح من التوتر مفاعل حيوي ومقلص من المحاور (هايدمان وBuxbaum 1990 ؛ فيستر ايواتا وآخرون 2004 ؛. Loverde ، Ozoka وآخرون 2011). وينبغي أن تشطف جيدا بالماء ركائز تعقيمها قبل وبعد طلاء يسين. ينبغي أن تطبق الطلاء من aliquots إذابة طازجة وموزعة بالتساوي قدر الإمكان. الأهم من ذلك ، ينبغي على ركائز لا يمكن نقله أو خلاف ذلك اضطراب خلال الفترة من الالتصاق. في خطوات لاحقة ، وتجنب الاتصال مع ركائز خلال الطلاء ، وجميع الحلول الماصة من نهاية بكثير من الممرات بعيدا عن واجهة الركيزة.

    يمكن التحمل في الاتصالات من كل مكون مفاعل حيوي واضح في شكل الركود. خلال الفترة الأولى من جماعة أبو سياف ، الترهل في النظام كما يتضح من الجدول الحركة الحركة الخطية الآلي يحدث دون وجود تحرك للكتلة السحب. يمكن أن تختلف والترهل في التجربة ، بل هو عادة <1MM في تجربتنا. لهذا السبب ، وهو "ما قبل التوتر" مرحلة التخلص من الترهل 1mm/day ، ليوم واحد يسبق الجدول الزمني للجماعة أبو سياف خلالها أجزاء مفاعل حيوي والبدء في إشراك حركة ركائز القطر.

    قد تكون مطلوبة لحل المشاكل إذا كانت الخطوة تشريد الجدول الحركة الخطية الآلي لا يطابق تشريد كتلة السحب بعد مرحلة ما قبل اكتمال التوتر. وترتبط متزامنة ، وتشريد غير دقيقة للكتلة السحب مع 'stiction' أو الاحتكاك ثابت داخل أجهزة السحب والثناء من المحول. لمنع حدوث هذه القضايا ، ينبغي التحقق من كتلة حركة السحب من جهة ، وبعد التجميع ، على حركة شبه سهل سلس. إذا ملزم يحدث ، ينبغي الافراج عن التجمع القطر قبل التجريب. صلابة كافية لمحول من الضروري أيضا ضمان دقة ، وتشريد متزامن لم يتم التغلب بواسطة stiction للأجهزة السحب.

    Disclosures

    هي براءة اختراع للاستطالة السابقين فيفو الميكانيكية للخلايا العصبية بموجب براءات الاختراع الأميركية # # 7429267 6264944 و.

    Acknowledgements

    وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق التوظيف NSF CBET - 0747615. فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. دوجلاس سميث وديفيد لMeaney F. الإرشاد والدعم.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    PolyEtherEtherKetone (PEEK) McMaster-Carr 8504K69 Custom made bioreactor chamber
    Polycarbonate McMaster-Carr 8574K28 Custom made bioreactor chamber lid
    Stepper motor Applied Motion Products, Watsonville, CA HT23-397
    Linear motion table Servo Systems, Montville, NJ MIPS-2-10-1.0mm
    Step motor drive controller Applied Motion Products, Watsonville, CA Si2035
    Aclar Structure Probe Inc., West Chester, PA 1859 Towing culture substrates
    No. 1 coverslip Brain Research Labs, Newton, MA 4865-1 Stationary culture substrate
    Silicon RTV McMaster-Carr 7587A37
    Cotton-tipped swabs McMaster-Carr 7074T62
    Poly-D-Lysine BD Biosciences 354210

    References

    1. Bernal, R., Pullarkat, P.A., et al. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99 (1), 018301 (2007).
    2. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102 (2), 379-389 (1984).
    3. Chetta, J., Kye, C., et al. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 650-665 (2010).
    4. Dennerll, T. J., Lamoureux, P., et al. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 3073-3083 (1989).
    5. Fu, S. Y. & Gordon., T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14 (1-2), 67-116 (1997).
    6. Gray, C., Hukkanen, M., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50 (4), 953-963 (1992).
    7. Heidemann, S.R. & Buxbaum, R.E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17 (1), 6-10 (1990).
    8. Heidemann, S.R. & Buxbaum, R.E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15 (1), 95-107 (1994).
    9. Heidemann, S.R., Lamoureux, P., et al. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
    10. Iwata, A., Browne, K.D., et al. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12 (1), 101-110 (2006).
    11. Lamoureux, P., Heidemann, S.R., et al. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70 (3), 135-149 (2010).
    12. Lamoureux, P., Zheng, J., et al. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118 (3), 655-661 (1992).
    13. Lindqvist, N., Liu, Q., et al. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1683-1690 (2010).
    14. Loverde, J. R., Ozoka, V.C., et al. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. in press, (2011).
    15. Lu, Y. B., Franze, K., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17759-17764 (2006).
    16. O'Toole, M., Lamoureux, P., et al. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94 (7), 2610-2620 (2008).
    17. Pfister, B.J., Bonislawski, D.P., et al. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580 (14), 3525-3531 (2006).
    18. Pfister, B.J., Gordon, T., et al. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39 (2), 81-124 (2011).
    19. Pfister, B.J., Iwata, A., et al. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
    20. Pfister, B.J., Iwata, A., et al. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153 (1), 95-103 (2006).
    21. Siechen, S., Yang, S., et al. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12611-12616 (2009).
    22. Smith, D.H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89 (3), 231-239 (2009).
    23. Smith, D.H., Wolf, J.A., et al. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7 (2), 131-139 (2001).
    24. Weiss, P., et al. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
    25. Zheng, J., Lamoureux, P., et al. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11 (4), 1117-1125 (1991).

    Comments

    5 Comments

    This is a nice article..thanks alot fr sharing this useful information..Please visit my blog also and share my ideas : http://dentistryandmedicine.blogspot.com/
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 24, 2011, 11:24 AM

    Could someone tell me what is the radius of cruvature of the "towing leg"? Was this critical to maintaining the ²-3 mm overlap described in the paper?

    Thanks
    Reply

    Posted by: AnonymousMay 21, 2013, 12:56 PM

    The towing legs were made by drilling a 0.5" hole in a square block, followed by some sanding, which yielded ² towing legs per block. So, the radius would be about 0.²5" for each leg. Frankly, the substrate interface is more art than science. If you have tension at the tip of the towing substrate where it contacts the stationary substrate, you will be successful. The numbers we provide merely help to recreate what we have done. Thanks for your questions, please post again if I can be of any further assistance.

    Reply

    Posted by: Joseph L.June 2, 2013, 12:48 AM

    How were the cells imaged during the stretching process? Do you have an incubator that allows live cell imaging?
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 23, 2013, 9:36 AM

    The bioreactor shown here was in fact used for live imaging atop the microscope stage. Air was circulated from a nearby incubator through luer lock ports (silver ports visible on fig 1a). A heating element was built into the base and a transparent heated lid was used to prevent condensation. All of the details were published in our 2011 Neurotrauma paper, reference #14.

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21663384
    Reply

    Posted by: Joseph L.July 23, 2013, 1:32 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter