The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
This article is a part of JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 67.202.9.192, User IP: 67.202.9.192, User IP Hex: 1137314240
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772, doi:10.3791/2772 (2011).
יתושים הם וקטורים עבור מספר גורמי מחלות ומזיקים כגון וירוס קדחת צהובה, טפילי מלריה ותולעים filarial. מעבדות חוקרת אנטי הפתוגן מרכיבים של מערכת החיסון המולדת של וקטור מחלת מין בתקווה ליצור יתושים מהונדס, כי הם מגיבים פתוגנים כגון 1, 2. מערכת החיסון המולדת של יתושים כולל כמה שורות של הגנה 3. פתוגנים שמצליחים לברוח המכשול שהוטלו על ידי יתוש אפיתל מצופה midgut 4 להיכנס hemolymph והמפגש hemocytes במחזור, מרכיבים תאיים חשובים לתמצת פתוגנים לבלוע 5, 6. החוקרים לא מצאו ראיות רקמות hematopoietic ב יתושים ראיות הנוכחי עולה כי מספר hemocytes קבוע על הופעתה מבוגרים המספרים בפועל עשוי לרדת כפי הגילאים יתושים 7. היכולת לזהות כראוי לאסוף hemocytes מפני חרקים חשוב מבחינה רפואית היא צעד חיוני ללימודי חסינות הסלולר. עם זאת, גודלו הקטן של יתושים נפח מוגבל של hemolymph מהווים אתגר לאיסוף תאים חיסוניים.
שתי שיטות לאיסוף הוקמה hemocytes יתושים כולל גירוש hemolymph מתוך חוטם לחתוך 8, ועקירה נפח (זלוף), שבו מלוחים מוזרק באזור necklike קרומי בין הראש לבין החזה (כלומר, צוואר הרחם) לבין hemolymph perfused נאסף מפתיחת קרוע באזור הדיסטלי של הבטן 9, 10. טכניקות אלו, לעומת זאת, מוגבלים על ידי התאוששות נמוכה של hemocytes וזיהום אפשרי על ידי תאים שומן בגוף, בהתאמה 11. לאחרונה שיטה המכונה התאוששות הזרקה / התאוששות גבוהה משופרת של immunocytes על ידי שימוש מאגרים קרישה תוך הפחתת רמות זיהום קשקשים ורקמות פנימיות 11. אמנם שיטה המאפשרת שיטה משופרת של איסוף ושמירה hemocytes לתרבות העיקרי, הוא טומן בחובו מספר שלבים הזרקה איסוף שאינם נחוצים אם המטרה היא לאסוף את הזרם, לתקן כתם hemocytes עבור אבחון. הנה, אנחנו מדגימים את השיטה שלנו של איסוף hemolymph יתוש המשלבת את הפשטות של זלוף, באמצעות מאגרים קרישה במקום תמיסת מלח, עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים.
שיטת איסוף hemocyte המתואר כאן הוא שונה משיטות שפורסמו בעבר ומאפשר לבודד את ההכנות נקי של hemocytes מ Aedes יתושים בצעדים פחות. בעוד עניין מיוחד שלנו טמון באפיון האוכלוסיות hemocyte ב Aedes יתושים, אנו מאמינים כי הטכניקה הזו יכול להיות מיושם על קבוצות אחרות יתוש לאחר הניסויים הראשוניים נערכים כדי לקבוע כרכים זריקה נכונה. פרוטוקול שלנו משתמשת מאגרים קרישה במקום תמיסת מלח והתשואות אוכלוסייה של hemocytes זה משקף במדויק את המספרים in vivo. עם זאת, אנו לא נקבעה התאמה של פרוטוקול שלנו לשמירה על hemocytes מבודד בתרבות.
אוסף של hemolymph דרך חוטם חתך הוכח על מנת להביא למספר הנמוך ביותר של hemocytes במחזור ולא יידונו עוד כאן. זלוף שיטות מבוססות, בעוד קל לנהל, יש ביקורת על ומאפשר רמה גבוהה יותר של זיהום רקמות פנימיות קשקשים 11. לאחרונה, גבוה הזרקה / התאוששות שיטות פותחו כדי לשפר את ההתאוששות של hemocytes, תוך הפחתת רמות של 11 מזהם, אך טומן בחובו מספר שלבים הזרקה איסוף. פרוטוקול שלנו להשיג את אותה רמת hemocytes התאושש מזהמים מופחת אבל עם זריקה פחות צעדים איסוף, ובכך מציע שיטה פשוטה אך מדויקת כדי להשיג ההכנות נקי של hemocytes. ראשית, צעד פשוט בפרוטוקול שלנו רגליים, כנפיים הסרת וקצה הבטן במיכל נפרד מהמקום שבו נאסף hemolymph תוצאות בהכנות שואב הרבה hemocytes. שנית, רווחי השיטה שלנו דיוק על ידי שימוש במחטים זכוכית שנערך בעל מחט מחוברת חיובית, עקירה microinjector. בעוד diluent יכול גם להיות מוזרק באמצעות כף יד מחטים או אחר המוחזק ביד התקנים משלוח, שימוש microinjector מגדילה את הדיוק של נפח המסירה ובעקבות התוצאות בנפח עקבית של hemolymph שנאספו. הניסויים שלנו מצביעים על כך כרכים זריקה משולבת של μl 9.5-10.5 (צעדים 4.1 ו 4.4) אפשרה לנו לאסוף בעקביות 9-10 μl של hemolymph מפני יתושים נקבה מוזרק (נתונים שלא פורסמו), ובכך לספק אחר מדד של עקביות לכימות אוכלוסיות hemocyte. השיטה שלנו מפשט אוסף הכולל ידי הסרת הצורך אחר המוחזק ביד מחטי הזרקה ו / או צינורות זכוכית נימי לאסוף hemolymph בדילול מלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
המחברים מבקשים להודות ג'ון פריי ובן פיטרסון לגידול יתושים. אנו מודים גם כריסטין דייוויס גארי רדיס לעזרה עם micrographs hemocyte. מחקר זה מומן על ידי אוניברסיטת ריצ'מונד אומנויות & המילגה המדע הקיץ AA Qayum ואנשי סגל להעניק א טלנג.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Schneider’s Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Hema3 stain kit | Fisher Scientific | 123-869 | |
| Glass needles (borosilicate with filament) | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | 1.0mm O.D. and 0.78mm I.D. |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| MicroInjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-PD | |
| Needle holder | Tritech Research, Inc. | MINJ-4 |
