黄熱病の蚊から血球を収集し、染色のためのプロトコルネッタイシマカ

Amina A. Qayum, Aparna Telang

Department of Biology, University of Richmond

1。血球コレクションの事前準備

1. （は98 mMのNaOHを、186 mMのNaCl、1.7 mMのEDTA、41 mMクエン酸、pH4.5の抗凝固剤）60％シュナイダーの培地、10％ウシ胎児血清（FBS）、および30％クエン酸緩衝液で構成される体液の希釈溶液を調製^11。 -20℃で保存することができます1.0mLのアリコートを作る（資料を参照してください）​​一度だけ各アリコートを使用してください。
2. ガラスエッチングのツールを使用して、一端に直径1cmの円形の得点によって顕微鏡用スライドガラス（75 × 25 × 1 mm）を準備する。また、2つの事前エッチング円と顕微鏡のスライドは、（例えば、フィッシャーサイエンティフィックまたはEMSの源）で購入することができます。蚊ごとにスライドガラスが必要となります。
3. ガラス針のセットを準備する（資料を参照）、以下の推奨設定（サッタインスツルメンツ、モデルP - 87）によるとプル。
   

   ヒートランプ5

   プル：45

   ヴェル：75

   時間：175

   圧力580

   
   このプーラーで提案された設定を使用して、我々は、約3mmのシャンクの長さと全体の長さは500 mm程度である針を構築する。事前に引っ張ら針はまた（例えばTritech研究）購入することができます。

2。血球コレクションの事前に微量注入器の準備

1. 製造元の指示に従って、インジェクターのニードルホルダーに引っ張ら針を挿入します。埋め戻しは、インジェクター（資料を参照）チューブ、注射器とは、製造元の指示に従って、鉱物油とガラスの針を引っ張った。

3。血球コレクションの事前にメスの蚊の準備

1. 氷と接触​​することができる小さな固体ケージの容器に15、成人女性を吸引除去する。深く十分なケージとすべての側面のその高さ全体が氷と接触しているので、氷の蚊と浸しケージ。これは、すべての蚊が低温にさらされるようになります。
   約8分まで、または冷たい麻酔の蚊は、彼らはもはやモバイルではありません。
2. うつ病のスライドにone蚊を置きます。このスライドは、注射のためのサイトとして機能します。

4。血球コレクション

1. プルガラス針に血リンパの希釈液の12μlを取り上げ、7位と8腹部セグメント間の蚊に溶液を注入するインジェクターを設定します。約3蚊が取り上げ合計12μlの体積の3から3.5μLを注入することができます。注入が行われる間、蚊を穏やかに鉗子で定位置に保持されるべきである。希釈剤の少量が注入されるから、鉱物油を防ぐために、針の先端に残るはず。注入後腹部には"充填"や肥大化になるはずです。
2. 5分で回復するために氷上で別々の清潔な容器に注入された蚊を置きます。蚊内部の抗凝固剤希釈液のインキュベーションでは、内部組織に付着した血球を取り除くのに役立ちます。平均で3〜5新鮮な蚊は、各5分間の回復期間中に注入することができる。
3. 回復の5分後、足、翼、そしてマイクロはさみを使って一度に各蚊つの腹部の先端（第8セグメントで）オフスニップ。これは、氷上に置く回復カップで行う必要があります。脚と翼を切断すると、コレクションのスライドに転送されるスケールの可能性を減らすことができます。注：あまりにも胸の付着部位に近い足と羽をカットしたり、エスケープする血リンパための他の開口部を作成する危険はありません。血リンパは、腹部の先端に作成された開口部を通して収集する必要があります。
4. 70％エタノールでのガラスエッチング顕微鏡スライドを洗浄し、キムワイプでそれを乾燥させます。位置1は、エッチングされた円の外側の端にスライド上に蚊を注入して回復した。新鮮な血リンパの希釈液の12μlをピックアップし、その中胸の横側に蚊にこのボリュームを注入するインジェクターを設定します。注入されるから、鉱物油を防ぐために - 希釈剤の全体量（10μlの約8）ではない、ほとんどの実現が。希釈剤の少量は、針の先端に残るはず。
5. カット腹部の開口部が1cmの円形の端になるように蚊を配置します。注入後希釈血リンパはマークされた領域内で収集する必要があります。針がmesothoracic注射部位から削除されると、鉗子の2つのアームの間に蚊を保持し、静かにエッチングされた丸い部分の上に血リンパを指示するために、これらの鉗子で腹部を圧迫を再開する。
6. 希薄化後の血リンパは約10分間、またはそれが目に見えて乾燥するまでスライド上で乾燥することができます。

5。血球固定と染色

1. ディップS：HEMA3 ^7（資料を参照）で別々に各スライドを染色たびに1秒のための固定液に5回の李徳、それぞれ1秒間と、最後に、ソリューションIIのディップスライドが3回、私は各1秒に対して3倍の溶液中でDipslide。 DI水でスライドの後ろをすすぐ。スライドの前面を洗浄してはいけません。ステンド組織を含むエッチングされた円の外側のスライドの前面にしみ、乾燥させます。
2. エッチングされた中心の周りに取り付け媒体（例えば、シュール/マウントまたはPolymount）を適用し、その上にカバースリップを配置。ようにカバースリップ（25 × 25 mm）の上を軽く押し下げてそのカバースリップ（ステンド組織を含むエッチング円を含む）でカバーエリア全体への封入剤が広がる。スライドは3時間または一晩の最低を乾かせてください。血球は、最適な可視化と画像の収集後2週間以内に表示する必要があります。

6。代表的な結果

ネッタイシマカ大人の女性から採取した固定とHEMA3ステンド血球の例を図1A - Cに示されています。図1Aは、我々は細胞質比（550x倍率^）〜11核のサイズが小さく、球形、回転楕円体の形状及び高に基づいてprohemocyteとして識別血球を示しています。図1Bは、回転楕円体の形状と核の比（550x倍率）の高い細胞質に基づいてoenocytoidとして分類血球を示しています。最後に、図1Cは、顆粒球型血球（550x倍率）を示しています。顆粒球は自然の中で、よりきめ細かなものであり、彼らはガラスの表面に付着するような形状と動作に、よりアメーバの傾向にある。血球タイピングおよび回復¹¹の以前に発行された基準を使用して、私たちの収集方法は、総血球の同じような数を生み出し、我々は同様に顆粒球は総血球^11（図2）の最大の割合を構成していることがわかった。

図1代表的なHEMA3固定、染色したprohemocyteの光学顕微鏡像（）、oenocytoid（B）、およびAEから顆粒球（C）。ネッタイシマカの大人の女性。 C =細胞質、N =核、G =顆粒。

図2。合計カウント±私たちの体液の希釈と収集法でメス蚊ごとに得られるすべての血球と顆粒球のSE。