Een In vivo Knaagdieren Model van krimp veroorzaakte letsel en niet-invasieve monitoring van de Recovery

1. Verwondingen in vivo model en de meting van isometrische koppel.

1. Deze procedures kunnen worden gebruikt voor ratten of muizen ^7,17,18. Om te beginnen, plaatst u het dier liggende onder inhalatie-anesthesie (~ 4-5% isofluraan voor de inductie in een inductie kamer, dan ~ 2% isofluraan via een neuskegel voor onderhoud) met behulp van een precisie-verdamper (cat # 91103, Vet Equip, Inc, Pleasanton , CA). Breng een steriel oogheelkundige room (Paralube Vet Zalf, PharmaDerm, Floham Park, NJ) om elk oog om de hoornvliezen beschermen tegen uitdrogen. Tijdens de procedure, is het dier warm gehouden door het gebruik van een warmtelamp geplaatst buiten de kooi en ten minste zes centimeter gehouden van het dier te allen tijde.
2. Bereid de huid door het verwijderen van haren en met het schoonmaken van met afwisselende scrubs van betadine en 70% alcohol op zaaien huid bacteriën te voorkomen in de weke delen of bot. Bevestig de juiste verdoving door het ontbreken van een diepe peesreflexen (geen voet terugtrekking in reactie op knijpen de voet). Een naald wordt met de hand geplaatst via de proximale tibia, om de ledematen te stabiliseren op het tuig (25G of 27G voor de muis). De naald mag niet in het voorste compartiment van het been.
3. Vergrendel de naald in een vaste positie, zodanig dat het dier op de rug ligt en de tenen zijn recht omhoog gericht. Een op maat gemaakte apparaat wordt gebruikt om de naald veilig en daardoor stabiliseren de been.
4. Plaats de voet van de ledemaat op een custom-bewerkte voetplaat (figuur 1). De as van de voetplaat is bevestigd aan een stepper motor (model T8904, NMB Technologies, Chatsworth, CA) en een koppel sensor (model QWFK-8M, Sensotec, Columbus, OH). De voet moet in eerste instantie, zodat deze loodrecht op de tibia worden uitgelijnd, zoals in figuur 1.
5. Gebruik transcutane elektroden (723.742, Harvard Apparatuur, Cambridge, MA) of subcutaan elektroden (J05 Naald Elektrode Naalden, 36BTP, Jari Elektrode Supply, Gilroy, CA) om de nervus fibularis stimuleren de buurt van de hals van de fibula, waar de zenuw ligt in een oppervlakkige positie. Bevestig visueel geïsoleerd dorsaalflexie door het uitvoeren van een serie van stuiptrekkingen (0,1 ms puls voor de muis en 1 ms puls voor de rat) voordat de voet is bevestigd. Zodra de voet is bevestigd aan de voetplaat met plakband, bevestigt een toename van de twitch amplitude in reactie op een toename van de spanning die tegengestelde spieren (plantarflexors) niet gelijktijdig gestimuleerd worden.
6. Voor letsel, en op geselecteerde tijdstippen na een blessure, is de maximale kracht met de capaciteit van de dorsiflexors geregistreerd als 'maximale isometrische koppel "(koppel zonder een verandering in spierlengte). Torque metingen zijn uitgevoerd op dezelfde rig dat wordt gebruikt om letsel te veroorzaken. Voordat u opneemt maximale isometrische koppel, de pulsamplitude is aangepast aan trillen spanning en de optimale positie van de enkel te optimaliseren, wordt bepaald door het geven van responsen op verschillende lengtes van de dorsiflexors. Na het behalen van een koppel-hoek bocht naar de optimale lengte van de dorsiflexors (rust lengte, aka Lo) te bepalen, is een koppel frequentie plot verkregen door geleidelijk verhogen van de frequentie van de pulsen gedurende een 200 ms puls trein. Een maximale tetanische contractie gesmolten wordt meestal verkregen bij 90-100 Hz. Drie afzonderlijke samentrekkingen en tetanische contracties worden geregistreerd en opgeslagen voor verdere analyse.
7. Gebruik commerciële software te (Labview versie 8.5, National Instruments, Austin, TX) te contractiele activering, het begin van de enkel rotatie, en het koppel het verzamelen van gegevens te synchroniseren. Stimulatie van de dorsiflexor spieren optreedt terwijl de computer-gestuurde motor tegelijkertijd beweegt de voetplaat in plantaire flexie, hetgeen leidt tot een verlenging krimp (ook wel "excentriek" contractie, die een verwonding van de spier veroorzaakt). De specifieke protocol is afhankelijk van de gewenste omvang van letsel gewenst door de onderzoeker. De omvang van letsel of beschadiging van het weefsel, kan worden gereguleerd door manipulatie van variabelen, zoals hoeksnelheid, timing van de spieren activering, bereik van de beweging, en het aantal verlenging contracties.
8. Voor het induceren van letsel, superponeren een verlenging samentrekking op een maximale isometrische contractie, variëren van het bereik van de beweging, snelheid van verlenging, en de timing van stimulatie als dat nodig is. Bijvoorbeeld, is een maximale isometrische contractie verkregen in de dorsiflexors en na 200 ms ze zijn verlengd met een geselecteerde snelheid te benaderen normale beweging (900 ° / sec). We hebben eerder aangetoond dat de activering voor de beweging en de mate van verlenging zijn belangrijke factoren bij het ​​verkrijgen van een blessure ^14. Het grootste deel van het koppel door de dorsiflexors is uit de TA ¹¹ en we hebben eerder aangetoond dat dit model leidt tot verwonding van deze spier ^5,13-15. De TA blijft gestimuleerd door verlenging.
9. Na een blessure, is het dier verwijderd uit het apparaat. De tibia pin isverwijderd, wordt het been weer schoongemaakt, en het dier wordt teruggegeven aan de kooi (geplaatst op een temperatuur-geregelde verwarming blok bij 37 ° C) en gevolgd tot herstel. Dit geldt ook voor te wachten tot het dier is wakker en mobiel. De dieren lijden er geen waarneembare pijn tijdens de procedure en er zijn geen zichtbare veranderingen in gang (bijv. kreupelheid) na letsel veroorzaakt door verlenging van weeën. Echter, is geschikt anti-pijn behandeling vervolgens toegediend (buprenorfine 0,05 tot 0,1 mg / kg elke 12 uur gedurende 48 uur na de operatie).

2. In situ meting van de gehele spierspanning.

1. Het dier wordt voorbereid en het scheenbeen is gestabiliseerd zoals hierboven beschreven in paragraaf 1.1 tot en met 1.3. Alle instrumenten is ingeschakeld op ten minste 30 minuten voorafgaand aan de test voor een goede kalibratie en de thermische drift van de krachtopnemer te minimaliseren.
2. Incise de huid anterior aan de enkel en verbreken de pees van de tibialis anterior spier (TA). Zorgvuldig stropdas 4,0 Ethicon zijde niet-resorbeerbare hechtdraad tot de pees en bevestig de Vicryl hechting aan de load cell via de meegeleverde S-haak (gewicht = 0,1 g), model FT03, Gras Instruments, Warwick, RI). Als alternatief kan een aangepaste klem (gewicht = 0,5 g) worden gebruikt om de pees hechten aan de Vicryl hechting (figuur 2).
3. De meetcel wordt gemonteerd op een micromanipulator (Kite Manipulator, World precisie-instrumenten Inc, Sarasota, FL), zodat de TA kon worden aangepast aan rust lengte en goed uitgelijnd (een rechte lijn te trekken tussen de van oorsprong en insertie). De TA is beschermd tegen koeling door een warmtelamp en tegen uitdroging door minerale olie. De signalen van de load cell (gekalibreerd voor iedere test) worden gevoed via een DC-versterker (model P122, Gras Instruments, Warwick, RI) om een ​​A / D-board te worden verzameld en opgeslagen door acquisitie software (PolyVIEW versie 2.1, Gras Instruments , Warwick, RI).
4. Bevestig de TA om de load cell en toepassen single samentrekkingen (rechthoekige puls van 1 ms) bij verschillende spier lengtes om L ₀ te bepalen. Muscle rust lengte, gemeten met behulp van remklauwen, is gedefinieerd als de afstand tussen de tuberositas tibiae en de myotendinous kruising. Op deze lengte, geleidelijk verhogen van de puls amplitude en dan de puls frequentie naar een kracht-frequentie relatie vast te stellen. Een maximaal gesmolten tetanische contractie wordt verkregen op ongeveer 90-100Hz (300 ms trein duur bestaat uit 0,1 ms of 1 ms pulsen). Gebruik 150% van de maximale stimulatie-intensiteit van de TA te activeren om maximale contractiele activering (P ₀₎ induceren. Maximale tetanische contracties kan herhaaldelijk worden uitgevoerd en uitgedrukt als percentage van de P _0, het verstrekken van een index van vermoeidheid op ieder gewenst moment in de tijd.

3. In vivo MR imaging en / of spectroscopie van knaagdieren skeletspieren.

Alle MRI en MRS is uitgevoerd op een Bruker Biospin (Billerica, MA) 7.0 Tesla MR-systeem uitgerust met een 12 cm helling te voegen (660 mT / m maximale helling, 4570 T / m / s maximale slew rate) loopt Paravision 5.0 software.

1. Het dier is verdoofd met verdampt isofluraan zoals hierboven beschreven in 1.1. Een MR-compatibele kleine dieren monitoring en gating systeem (SA Instruments, Inc) wordt gebruikt om ademhaling en de lichaamstemperatuur te controleren. Muis lichaamstemperatuur is gehandhaafd op 36-37 ° C met behulp van een warm water circulatiepomp. Een op maat gemaakte houder wordt gebruikt om de muis positie in de rugligging met beide benen parallel aan de boring van de magneet van knie tot voet. Een vier-kanaals ontvangen-alleen aan de oppervlakte spoel wordt geplaatst in een 72 mm lineaire 1H resonator. De resonator spoel is afgestemd en aangepast aan de steekproef.
2. MR Beeldvorming: Na lokalisators, de volgende MR-scans worden uitgevoerd: T1-gewogen snelle verwerving met ontspanning enhancement (RARE) met de volgende parameters: TE = 9,52 ms, TR = 1800, echo treinlengte = 4, in het vlak resolutie van 100x100 micrometer , en slice dikte = 750 um. Dual-echo PD/T2 RARE: TE = 19.0/57.1 ms, TR = 5000 ms, echo treinlengte = 4, in het vlak resolutie van 100x100 micrometer, en slice dikte = 750 um. Spin echo (SE) diffusie-tensor beeldgegevens met behulp van 12 niet-colineair richtingen: b-waarde = 350 s / mm ^-2, TE = 26 ms, TR = 4500 ms, in het vlak resolutie van 150x150 micrometer, en slice dikte = 750 micrometer . Multi-slice multi-echo (MSME) T2 parametrische in kaart brengen van gegevens met behulp van 16 TF = 11,4 ms tot 182,5 ms met ΔTE = 11,4 ms, TR = 10000 ms, in het vlak resolutie van 150x150 micrometer, en slice dikte = 750 um.
3. Beeldverwerking: Diffusion Tensor wederopbouw en tractography is uitgevoerd met behulp van TrackVis (Martinos Center for Biomedical Imaging; Massachusetts General Hospital, Boston, MA) betekent diffusiviteit (MD), fractionele anisotropie (FA) beelden evenals tractography kaarten maken. T2 mapping wordt uitgevoerd met behulp van aangepaste software geschreven in MAT LAB (The Mathworks, Natick, MA) met behulp van niet-lineaire kleinste kwadraten om de gemeten gegevens aan te passen aan elke pixel van de canonieke T2 signaal vergelijking. Regio's van belang de metingen worden uitgevoerd om parameterwaarden kan beoordelen binnen de TA.
4. 1H spectroscopie: Geautomatiseerde shimming wordt uitgevoerd op een 1 x 1 x 4 mm ³ voxel in de TA. Een punt-opgelost spectroscopie (PERS) pulssequentie (TR / TE = 2000/18 ms) wordt gebruikt om spectra te verkrijgen van dezelfde voxel met 1024 gemiddelden. Data acquisitie is het 34 minuten op elk been. Spectrale gegevens worden verwerkt met behulp van de LCModel pakket ^16. 31P spectroscopie: Een dual-tuned (1H, 31P) oppervlak spoel wordt gebruikt om niet-gelokaliseerde uit te voeren (met behulp van een enkele puls experiment) of lokale spectroscopie het gebruik van de afbeelding is geselecteerd in vivo spectroscopie (ISIS) pulssequentie.

4. Oogsten en opslaan van spieren.

TA worden geoogst na aan het einde van experimenten, gewogen, snap ingevroren in vloeibare stikstof, en vervolgens opgeslagen bij -80 ° C. Dit kan worden uitgevoerd op elk moment in de tijd na de in vivo experimenten. Spieren worden geoogst onmiddellijk na de in situ experimenten, want dit is een terminal procedure. Voor gedetailleerde morfologische studies, is het dier vast met 4% paraformaldehyde via perfusie door de linker ventrikel.

5. Representatieve resultaten.

Figuur 3 toont representatieve gegevens van een rat in de in vivo apparaat De in-vivo-apparaat wordt gebruikt om maximale koppel gegenereerd door de dorsiflexor spieren te verkrijgen;. Het wordt ook gebruikt om letsel ertoe te brengen deze zelfde spieren. Vanwege de lengte-spanning relatie van spieren, maximale isometrische koppel treedt gewoonlijk op als het enkelgewricht bevindt zich op ongeveer 20 ° plantairflexie (met de voet loodrecht gepositioneerd om de tibia als 0 °). Na de maximale isometrische koppel is verkregen, kan de voet vervolgens worden geplaatst in elke positie zijn om de schade protocol beginnen. Figuur 3 geeft een blessure protocol van 30 herhalingen met een boog van beweging van 0 ° - 70 °. Let op de gestage daling van het koppel gegenereerd uit de isometrische fase (gevulde pijl) en verlenging fase (open pijl) tijdens de contractie-geïnduceerde letsel protocol. Het koppel wordt gemeten in eenheden van Nmm, maar de absolute waarde is afhankelijk van de grootte van het dier en de toestand ervan (bijvoorbeeld gewonde spier, spier vermoeid, of spier ontbreekt een bepaald eiwit als gevolg van homologe recombinatie).

Figuur 4 toont representatieve gegevens van een rat in de in situ apparaat. Onze in situ apparaten niet gepaard gaat met een verlenging van de weeën, maar veeleer stelt ons in staat te isoleren, goed af te stemmen, en meet de maximale spanning die door een individuele spieren op een bekende lengte. Figuur 4 toont de geleidelijke verlies van kracht, die optreedt tijdens een test in een vermoeidheid tibialis anterior spier van een rat. In dit specifieke voorbeeld, werden titanische contracties uitgevoerd eenmaal per seconde gedurende 5 minuten. Spanning (kracht) is meestal opgenomen in Newton (of gram), maar net als koppel, de absolute waarde afhankelijk van de grootte en de conditie van het dier. Omdat de spier gewicht is verkregen onmiddellijk na deze procedure, kan de kracht worden genormaliseerd (de zogenaamde "specifieke kracht") om de spieren dwarsdoorsnede.

Figuur 5 toont representatieve gegevens van in vivo beeldvorming van een muis, zoals T1-gewogen en T2 parametrische mapping (A), 3D-tractography van Diffusion Tensor Imaging (B), ^een H-spectroscopie (C), en ³¹ P-spectroscopie. Details worden verstrekt in de figuur legende.

Figuur 1: in vivo toestel .* om de schade te produceren, het scheenbeen is gestabiliseerd en de voet bevestigd aan een motor aangedreven plaat. De enkel dorsiflexors worden gestimuleerd via de nervus fibularis, terwijl de voetplaat dwingt de voet in plantairflexie (gestippelde pijl).
* Lovering & De Deyne, J Biomechanica 2005, gebruikt met toestemming.

Figuur 2: In situ apparaat De meetcel wordt gemonteerd op een micromanipulator, zodat de TA kon worden aangepast aan de lengte rusten en goed uitgelijnd in de X-, Y-en Z-richting. De distale pees van de TA is bevestigd aan de load cell en single samentrekkingen worden geïnduceerd bij verschillende spier lengtes om L ₀ te bepalen. Een maximale tetanische contractie wordt verkregen tot maximale contractiele activering (P ₀₎ te bepalen. Maximale tetanische spanning kan herhaaldelijk worden uitgevoerd en uitgedrukt als percentage van de P _0, het verstrekken van een index van vermoeidheid op een gewenst punt in de tijd.

782/2782fig3.jpg "alt =" Figuur 3 "/>
Figuur 3: Koppel de gegevens van in-vivo-apparatuur vertegenwoordiger spoor opnames een koppel van verlenging contracties in de rat. In dit specifieke voorbeeld, waren de spieren gestimuleerd voor 200 milliseconden tot een piek isometrische contractie (gevuld pijl) veroorzaken voor verlenging (open pijl) door de voetplaat door middel van een 70 ° boog van beweging op een hoeksnelheid van 900 ° / s.

Figuur 4: Spanning gegevens van in situ apparaten vertegenwoordiger van gegevens waaruit blijkt dat de daling van de maximale isometrische tetanische spanning tijdens herhaalde stimulatie van de m. tibialis anterior spier (TA) in een rat. In dit voorbeeld werd de TA geïsoleerd, aangepast aan de optimale lengte (L ₀₎ en vervolgens gestimuleerd met een 200 ms tetanische contractie een keer per seconde gedurende 5 minuten.

Figuur 5: in vivo beeldvorming A: De beelden tonen dwarse (axiaal) delen van de T1-gewogen en T2 parametrische mapping van de tibialis anterior spier (TA). De gestippelde rode box rond de TA om aan te tonen verhoogde verhoogde T2 in de gewonde (links) versus niet gewond (rechts) B:.. Representatieve 3D tractography van Diffusion Tensor Imaging (DTI) C: De ^een H-spectrum van een muis TA toont verschillende detecteerbare lipide resonanties; differentiatie tussen intramyocellular (IMCL) en extramyocellular lipide (EMCL) pieken is verkregen met behulp van deze methode D: De ³¹ P MR spectrum van de rat TA toont phosphocreatine (PCR), anorganisch fosfaat (Pi), en de drie. resonanties (α, β, γ) van adenosine 5'-trifosfaat (ATP).

"Muscle schade" is gedefinieerd en gemeten op vele manieren. Structurele schade is zichtbaar in histologische bevindingen ^6,9, maar een probleem met veel van de biologische markers gebruikt om de spieren letsel, waaronder die in diervoeding gebruikte studies te beoordelen, is dat ze meestal niet correleren met het verlies van kracht. Spierschade wordt vaak gedefinieerd in het kader van de test gebruikt worden om het te onderzoeken en niemand kan het vinden van rekening voor de veranderingen in de contractiliteit na letsel. Sinds de volledige contractiele functie kan blijven bestaan ​​ondanks de aanwezigheid van letsel markers, kan verlies van kracht worden de meest valide maat van letsel ^3, en waarschijnlijk het meest relevant.

Het is moeilijk om spierblessures bij de mens bestuderen, aangezien de incidentie is een willekeurige gebeurtenis die is moeilijk te voorspellen en de klinische presentatie varieert sterk. Dus veel van de gegevens met betrekking spierblessures zijn vastgesteld uit studies op dieren, die de controle over een groot aantal variabelen en de mogelijkheid om de mechanismen van schade en herstel studie verschaft. De in vivo blessure apparaten die we hebben beschreven biedt een methode voor het beoordelen van contractiele functie zonder dat het ontleden van de spieren, en dus zonder de noodzaak om het dier te laten inslapen onder studie. Onze op maat ontworpen letsel model (octrooi aangevraagd) is gebaseerd op dezelfde principes gebruikt door andere om krimp-geïnduceerde schade vast te stellen bij dieren ^5,12,15,24. Ondanks de beschikbaarheid van modellen in de markt, is er weinig instructie buiten het gebruik van de hardware. Ons model heeft de specificaties in termen van beschikbare bereik van de beweging en hoeksnelheid die voordelige ^17, maar ons belangrijkste doel is het delen van de methoden, we hebben geprobeerd om de procedures te beschrijven van begin tot eind voor het produceren van een blessure. Voordelen van de in vivo model zijn dat de spier, de anatomie en biomechanica niet zijn gewijzigd en dat de procedure is niet terminal. We maken gebruik van dezelfde locatie in het scheenbeen voor alle torsie metingen, volgende sanitaire procedures en het gebruik van een steriele naald voor elke meting. Het been kunnen worden gestabiliseerd zonder het gebruik van een transosseus pin, maar we hebben gevonden de pin te superieur in termen van betrouwbaarheid en het elimineren van overbodige beweging tijdens de verlenging weeën.

Het apparaat gebruikt worden voor in vivo metingen koppel heeft een aantal extra voordelen. Het brengt geen dissectie, dus er is geen noodzaak om het dier laten inslapen onder studie. Het resultaat is dat men de contractiliteit meten in hetzelfde dier na verloop van tijd, en / of met in vivo beeldvorming, zoals MRI. Andere voordelen zijn dat de normale anatomie is niet veranderd, de zenuw is niet genegeerd voor stimulatie (zoals voor in vitro preparaten), en de spier blijft in zijn normale omgeving, zodat de effecten van ontsteking, hormonen of andere factoren kunnen worden bestudeerd. Omdat het vereist het gebruik van minder dieren, waarvan de spieren zijn onderworpen aan minder manipulaties (bijv. dissectie voorafgaand aan de test van de functie), geven wij de voorkeur aan het koppel metingen gebruiken waar mogelijk. Op het moment dat arm van de muis TA is bekend ⁴ en de spier kan worden afgewogen wanneer het dier is geslacht. Er zijn een aantal beperkingen echter, in vergelijking met het isoleren van de spier. Bijvoorbeeld, is het moeilijk te weten wat de precieze lengte veranderingen die optreden tijdens de verlenging de weeën, en de spiermassa kan niet worden gemeten tot het geoogst (hoewel het kan worden geschat op basis van volume gemeten via MRI) ^8.

Voor het bepalen van de "specifieke kracht" (kracht per eenheid van de dwarsdoorsnede) van een individuele spier, die spier moet worden geïsoleerd en goed gepositioneerd, dit vermijdt ook krachtoverbrenging van nabijgelegen spieren ^10. De in situ apparaat werd ontworpen voor dit doel. Het biedt een alternatief voor het meten van de contractiliteit van slechts een spier met een bekende lengte en massa. Maar deze methode heeft ook beperkingen. Hoewel de in situ apparaat biedt meer experimentele controle bij het ​​meten van de kracht van een individuele spieren, de trade-off is dat het experiment minder fysiologische. In situ kracht metingen vereisen een chirurgische release van de TA spier, die de anatomie kan veranderen en beïnvloeden krachtoverbrenging. Het experiment is ook terminal, zodat de spier kan niet worden gevolgd in de tijd.

Diffusion Tensor Imaging (DTI) is in potentie een nog gevoeliger en eerder marker voor spierschade dan standaard T2-gewogen MRI. De variabelen verkregen met DTI, tenminste in andere weefsels zoals de hersenen (1), tonen een sterke en snelle respons op schade, terwijl de T2-signaal kan een langere periode te veranderen te nemen. DTI is gebaseerd op het meten van de schijnbare diffusie van water in de weefsels. De DTI techniek is ten opzichte van de werkelijke langsdoorsnedes van de rat TA en het is aangetoond dat de DTI richtingen eigenlijk lokale spiervezel richtingen in de rat TA spier ¹⁹ vertegenwoordigen.

MRS biedt informatie over de chemische samenstelling van de spier niet-invasief ^12. Afhankelijk van de waargenomen kern, MRS maakt observatie van hoog-energetische fosfaten ⁽³¹ P MRS) of lipiden ⁽¹ H MRS). ³¹ P MRS is een ideaal hulpmiddel voor het onderzoeken van spier-metabolisme, omdat het niet-invasief en kan gemakkelijk worden toegepast op de in vivo studies van de skeletspieren. Alternatieve benaderingen van de biochemische test van in situ spier metabolieten, zoals naaldbiopsie, kan aanzienlijke overschatting van Pi en schijnbare vermindering van PCR ^1. Een dier model biedt het onmiskenbare voordeel van het gebruik van een gecontroleerde letsel en het vergelijken van in vivo MRS wijzigingen bevindingen in de biochemie, morfologie en functie van het weefsel. Veranderingen in de hoge-energie-fosfaat metabolisme worden aangetroffen bij ziekten die leiden tot spier-degeneratie ^2,20. Intracellulaire pH, evenals de MR signaal intensiteit ratio's Pi / PCR (anorganisch fosfaat [Pi] te phosphocreatine [PCr]), en PDE / PCR (fosfodiester [PDE] om PCR), kan waardevolle informatie over het stadium en de ernst van de spier-degeneratie.