En In vivo Gnagarmodell av kontraktion inducerad-skada och icke-invasiv övervakning av Recovery

1. In vivo skador modell och mätning av isometrisk vridmoment.

1. Dessa förfaranden kan användas för råttor eller möss ^7,17,18. Till att börja placera djuret liggande i inhalationsanestesi (~ 4-5% isofluran för induktion i en induktion kammare, sedan ~ 2% isofluran via en nosecone för underhåll) med en precision Vaporizer (katt # 91.103, Vet Equip, Inc, Pleasanton , CA). Applicera sterilt oftalmiska grädde (Paralube Vet Salva, PharmaDerm, Floham Park, NJ) till varje öga för att skydda hornhinnor från att torka. Under förfarandet är att djuret hålls varmt med hjälp av en värmelampa placeras utanför buren och hålls minst 6 inches från djur som vid alla tillfällen.
2. Prep huden genom att ta bort hår och genom att rengöra med omväxlande skurar av Betadine och 70% alkohol för att förhindra att bakterier seeda huden in i mjuk vävnad eller ben. Bekräfta korrekt anestesi av brist på ett djupa senreflexer (ingen fot tillbakadragande som svar nypa foten). En nål är manuellt placeras genom proximala tibia för att stabilisera lem på rigg (25G eller 27G för mus). Nålen bör inte komma in i främre facket i benet.
3. Lås in nålen i en fast position, så att djuret liggande och tårna står inför rakt upp. En specialanpassad produkt används för att säkra nålen och därmed stabilisera benet.
4. Placera foten av lem på en specialbyggd bearbetad fotplatta (Figur 1). Axel fotplattan är fäst vid en stegmotor (modell T8904, NMB Technologies, Chatsworth, CA) och ett vridmoment sensor (modell QWFK-8M, Sensotec, Columbus, OH). Foten bör inledningsvis anpassas så att det är vinkelrätt mot skenbenet, som i figur 1.
5. Använd transkutan elektroder (723.742, Harvard Apparater, Cambridge, MA) eller subkutant elektroder (J05 Needle elektrod Needles, 36BTP, Jari elektrod Supply, Gilroy, CA) för att stimulera fibular nerven nära halsen av vadbenet, där nerven ligger i ett ytliga läge. Visuellt bekräfta isolerade dorsalflexion genom att utföra en serie av ryckningar (0,1 ms puls för mus och 1 ms puls för råtta) innan foten är säkrad. När foten sitter fast fotplattan med tejp, bekräftar en ökning rycka amplitud som svar på en ökning av spänningen att motsatta muskler (plantarflexors) inte samtidigt stimuleras.
6. Före skada, och vid utvalda tidpunkter efter en skada, är den maximala kraft som åstadkommer kapacitet dorsiflexors registreras som "maximal isometrisk vridmoment" (moment utan en förändring i muskeln längd). Moment mätningar på samma rigg som används för att framkalla skada. Innan inspelningen maximal isometrisk vridmoment är pulsamplitud justeras för att optimera rycka spänningar och den optimala placeringen av fotleden bestäms genom att ge ryckningar i olika längder av dorsiflexors. Efter att ha fått ett vridmoment vinkel kurva för att bestämma den optimala längden på dorsiflexors (vilande längd, aka Lo), är ett moment frekvens tomt som erhålls genom att successivt öka frekvensen av pulser under 200 ms pulståg. En maximal smält tetanic kontraktion fås vanligtvis på 90-100 Hz. Tre separata ryckningar och tetanic sammandragningar registreras och sparas för vidare analys.
7. Använda kommersiell programvara för att (Labview version 8,5, National Instruments, Austin, TX) för att synkronisera kontraktila aktivering, uppkomsten av fotled rotation och uppgifter vridmoment samling. Stimulering av dorsiflexor muskler inträffar medan datorstyrda motorn samtidigt flyttar fotplattan till plantarflexion, vilket leder till en förlängning kontraktion (även kallad "excentriska" kontraktion, som orsakar skador i muskler). Det särskilda protokollet beror på den önskade omfattningen av skada som önskas av prövaren. Omfattningen av skador, eller vävnadsskador kan regleras genom manipulation av variabler såsom vinkelhastighet, tidpunkt för muskelaktivering, rörelseomfång, och antalet förlängning sammandragningar.
8. Att framkalla skada, lägga på en förlängning kontraktion på en maximal isometrisk kontraktion, varierande utbud av rörelse, hastighet på förlängning, och tidpunkten för stimulans som behövs. Till exempel är en maximal isometrisk kontraktion erhålls i dorsiflexors och efter 200 ms att de förlängs på en vald hastighet till ungefär normal rörlighet (900 ° / sek). Vi har tidigare visat att aktivering innan rörelsen och graden av förlängning är viktiga faktorer för att få en skada ^14. Majoriteten av vridmoment som produceras av dorsiflexors är från TA ¹¹ och vi har visat tidigare att denna modell resulterar i skada på denna muskel ^5,13-15. TA är stimulerade hela förlängning.
9. Efter skada, är djuret bort från apparaten. Den tibial stift ärbort, är benet rengöras igen, och djuret tillbaka till buren (placeras på en tempererad värmeblock vid 37 ° C) och kontrolleras tills återhämtning. Detta inkluderar att vänta tills djuret är vaken och mobil. Djuren drabbas av några observerbara smärta under förfarandet och det finns inga synliga förändringar i gång (t ex hälta) efter skada orsakad av förlängning sammandragningar. Det är lämpligt anti-smärtbehandling ges senare (buprenorfin 0,05 till 0,1 mg / kg var 12 timmar för 48 tim efter operation).

2. In situ mätning av hela muskelspänningar.

1. Djuret är beredd och skenbenet stabiliseras enligt ovan i avsnitt 1.1 genom 1.3. Alla instrument är påslagen i minst 30 minuter innan testet för korrekt kalibrering och för att minimera termisk driften av kraftgivare.
2. Incise huden främre till ankeln och bryta senan i tibialis anterior muskeln (TA). Noggrant slips 4,0 Ethicon siden icke-resorberbar tråd till senan och fäst vicryl sutur att belastningsmätaren via den medföljande S-krok (vikt = 0,1 g), modell FT03, Grass Instrument, Warwick, RI). Alternativt kan en anpassad klämma (vikt = 0,5 g) användas för att fästa senan till vicryl suturen (Figur 2).
3. Den lastcell är monterad på en mikromanipulator (Kite Manipulator, World precisionsinstrument Inc, Sarasota, FL) så att TA kan anpassas till vila längd och rätt placerad (en rak linje dras mellan ursprung och insättning). TA är skyddad från kyla med en värmelampa och från uttorkning av mineralolja. Signalerna från lastcellen (kalibreras före varje provning) matas via en DC-förstärkare (modell P122, Gräs Instrument, Warwick, RI) till en A / D-styrelsen skall samlas in och lagras av förvärv programvara (PolyVIEW version 2.1, Grass Instrument , Warwick, RI).
4. Fäst TA till lastcell och applicera enstaka ryckningar (rektangulär puls på 1 ms) vid olika muskel längder för att avgöra L _0. Muscle vila längd, mätt med skjutmått, definieras som avståndet mellan tibia ischii och myotendinous korsningen. Vid denna längd, gradvis öka pulsamplitud och sedan pulsfrekvens att upprätta en kraft-frekvens relation. Ett maximalt smält tetanic sammandragning erhålls vid ca 90-100Hz (300 ms tåg tid består av 0,1 ms eller 1 ms pulser). Använd 150% av den maximala stimuleringen intensitet att aktivera TA för att få maximal kontraktila aktivering (P _0). Maximal tetanic sammandragningar kan utföras upprepade gånger och uttryckt i procent av P _0, vilket ger ett index över trötthet vid önskad tidpunkt.

3. In vivo MR och / eller spektroskopi av gnagare skelettmuskulatur.

Alla MRI och MRS utförs på en Bruker Biospin (Billerica, MA) 7,0 Tesla MR-system utrustat med en 12 cm lutning in (660 mT / m maximala lutningen, 4570 T / m / s maximal utvridning ränta) kör Paravision 5,0 mjukvara.

1. Djuret bedövas med förångas isofluran som beskrivs ovan i 1.1. En MR-kompatibel små djur övervakning och slussning systemet (SA Instruments, Inc.) används för att övervaka andningsfrekvens och kroppstemperatur. Mus kroppstemperaturen hålls på 36-37 ° C med en varmt vatten cirkulationspump. En skräddarsydd hållare används för att placera musen i ryggläge med båda benen parallellt med hålet i magneten från knät till foten. En fyra-kanal enbart mottagning ytan spole placeras inom en 72 mm linjär 1H resonator. Den resonatorn spolen är avstämd och matchas till provet.
2. MR: Efter lokaliserare är följande MR utförs: T1-viktade snabba förvärv med avkoppling förbättring (sällsynt) med följande parametrar: TE = 9,52 ms, TR = 1800, eko tåg längd = 4, i-planet upplösning 100x100 ìm , och skiva tjocklek = 750 ìm. Dual-eko PD/T2 sällsynta: TE = 19.0/57.1 ms, TR = 5000 ms, eko tåg längd = 4, i-planet upplösning 100x100 ìm, och skiva tjocklek = 750 ìm. Spin eko (SE) diffusion tensor bilddata med 12 icke-Kolinjär håll: b-värde = 350 s / mm ^-2, TE = 26 ms, TR = 4500 ms, i-planet upplösning 150x150 ìm, och skiva tjocklek = 750 ìm . Multi-skiva med flera ECHO (MSME) T2 parametriska kartdata med hjälp av 16 TES = 11,4 ms till 182,5 ms med ΔTE = 11,4 ms, TR = 10000 ms, i-planet upplösning 150x150 ìm, och skiva tjocklek = 750 ìm.
3. Bildbehandling: Diffusion tensor återuppbyggnad och tractography utförs med TrackVis (Martinos Center for Biomedical Imaging, Massachusetts General Hospital, Boston, MA) för att skapa betyda diffusivitet (MD), fraktionerad anisotropi (FA) bilder samt kartor tractography. T2 kartläggning görs med anpassad mjukvara skriven i MAT LAB (The MathWorks, Natick, MA) med icke-linjär minsta kvadrat för att passa den uppmätta data vid varje pixel till de kanoniska T2 signal ekvation. Regioner av intresse mätningar utföras för att bedöma parametervärden inom TA.
4. 1H spektroskopi: Automatiserad mellanlägg utförs på ett 1 x 1 x 4 mm ³ Voxel i TA. En punkt-löst spektroskopi (tryck) pulssekvens (TR / TE = 2000/18 ms) används för att förvärva spektra från samma Voxel med 1024 genomsnitt. Datainsamling är 34 minuter på varje ben. Spektrala data bearbetas med ¹⁶ LCModel paketet. 31P spektroskopi: En dubbel-trimmad (1H, 31P) yta spole används för att utföra icke-lokaliserad (med hjälp av en enstaka puls experiment) eller lokala spektroskopi använda bilden väljas in vivo spektroskopi (ISIS) pulssekvens.

4. Skörd och lagring muskler.

Terapiområden är skördas efter i slutet av experiment, vägde, snap frysta i flytande kväve och sedan förvaras vid -80 ° C. Detta kan utföras när som helst i tid efter in vivo-experiment. Muskler skördas direkt efter in situ experiment, eftersom detta är en terminal förfarande. För detaljerade morfologiska studier, är djuret fixeras med 4% paraformaldehyd via perfusionen genom vänster kammare.

5. Representativa resultat.

Figur 3 visar representativa uppgifter från en råtta in vivo apparaten In vivo-apparaten används för att få maximalt vridmoment som genereras av dorsiflexor musklerna,. Det är också används för att framkalla skada på samma muskler. På grund av längden spänningen förhållandet mellan muskler, uppträder maximal isometrisk vridmoment vanligtvis när fotleden är placerad vid ca 20 ° plantarflexion (med foten placerad vinkelrätt mot skenbenet vara 0 °). Efter maximal isometrisk vridmoment erhålls, kan foten sedan placeras i valfritt läge för att börja skada protokollet. Figur 3 representerar en skada protokollet av den 30 repetitioner med en båge av rörelse från 0 ° - 70 °. Notera den stadiga nedgången i vridmoment som genereras av isometrisk fas (fylld pil) och förlänga fas (öppen pil) under kontraktion-inducerade skador protokollet. Vridmoment registreras i enheter om NMM, men det absoluta värdet beror på storleken på djuret och dess skick (t.ex. skadade muskler, trött muskel eller muskler som saknar ett visst protein på grund av homolog rekombination).

Figur 4 visar representativa uppgifter från en råtta i in situ-apparaten. Vår på plats apparaten inte innebär en förlängning sammandragningar, utan gör det möjligt för oss att isolera, väl anpassa och mäta maximal spänning som produceras av en enskild muskel vid en känd längd. Figur 4 visar den gradvisa förlusten av kraft som uppstår under en trötthet test i en tibialis anterior muskeln i en råtta. I detta exempel var titanic sammandragningar utföras en gång varje sekund i 5 minuter. Spänning (kraft) är normalt inspelad i Newton (eller gram), men precis som vridmoment, beror det absoluta värdet på storlek och skick av djuret. Eftersom muskler väger erhålls omedelbart efter detta förfarande kan kraften normaliseras (kallas "särskilda kraft") till muskeln tvärsnittsarea.

Figur 5 visar representativa data från in vivo-avbildning av en mus, såsom T1-viktade och T2 parametrisk mappning (A), 3D tractography från diffusion tensor imaging (B), ¹ H spektroskopi (C) och ³¹ P-spektroskopi. Detaljer ges i figuren legenden.

Figur 1: in vivo-apparater .* För att producera skadan är skenbenet stabiliserats och foten fäst en motordriven plåt. Ankeln dorsiflexors stimuleras via fibular nerven medan fotplattan tvingar foten till plantarflexion (streckad pil).
* Lovering & De Deyne, J Biomekanik 2005, används med tillstånd.

Figur 2: In situ-apparater Den lastcell är monterad på en mikromanipulator så att TA kan anpassas till vila längd och rätt placerad i X, Y och Z-riktning. Den distala senan i TA är knuten till lastcell och enstaka ryckningar induceras vid olika muskel längder för att avgöra L _0. En maximal tetanic kontraktion erhålls för att fastställa maximal kontraktila aktivering (P _0). Maximal tetanic spänning kan utföras upprepade gånger och uttryckt i procent av P _0, vilket ger ett index över trötthet vid önskad tidpunkt.

782/2782fig3.jpg "alt =" Bild 3 "/>
Figur 3: Moment uppgifter från in vivo-apparater representant spåra inspelningar av vridmoment från förlängning sammandragningar hos råtta. I detta exempel har muskler stimuleras för 200 millisekunder för att inducera en topp isometrisk kontraktion (fylld pil) innan förlängning (öppen pil) av fotplattan genom en 70 ° båge rörelseförmågan i en vinkelhastighet 900 ° / s.

Figur 4: Spänningar data från in situ-apparater representativa uppgifter som visar minskningen i maximal isometrisk tetanic spänningen vid upprepad stimulering av tibialis anterior muskeln (TA) i en råtta. I detta exempel var TA isolerade, justerat till optimal längd (L ₀₎ och sedan stimuleras med en 200 ms tetanic sammandragning en gång varje sekund i 5 minuter.

Figur 5: in vivo imaging A: Bilderna visar tvärgående (axiellt) avsnitt av T1-viktade och T2 parametriska kartläggning från tibialis anterior muskeln (TA). Den streckade röda rutan omger TA att visa ökad ökad T2 i den skadade (vänster) jämfört med oskadade (höger sida) B:.. Representant 3D tractography från diffusion tensor imaging (DTI) C: ¹ H spektrum av en mus TA visar flera upptäckas lipid resonanser, differentiering mellan intramyocellular (IMCL) och extramyocellular lipider (EMCL) toppar erhålls med denna metod D: ³¹ P MR spektrum av råttans TA visar phosphocreatine (PCR), oorganiskt fosfat (Pi), och de tre. resonanser (α, β, γ) av adenosin 5'-trifosfat (ATP).

"Muskel skada" har definierats och mätas på många sätt. Strukturella skador syns i histologiska fynd ^6,9, men ett problem med många av de biologiska markörer används för att bedöma muskelskada, inklusive de som används i djurförsök, är att de oftast inte korrelerar med förlusten av kraft. Muskelskada definieras ofta inom ramen för analysen används för att undersöka det och ingen hitta kan redogöra för förändringar i kontraktiliteten efter skada. Eftersom hela kontraktila funktion kan finnas kvar trots förekomsten av skada markörer, kan förlusten av våld vara den mest giltiga mått av skada ^3, och förmodligen den mest relevanta.

Det är svårt att studera muskelskador hos människor, eftersom förekomsten är en slumpmässig händelse som är svår att förutsäga och den kliniska bilden varierar stort. Därför är många av de uppgifter om muskelskador har konstaterats från studier på djur, som ger kontroll över många variabler och möjligheten att studera mekanismer för skador och återhämtning. In vivo skada apparater vi har beskrivit ger en metod för att bedöma kontraktila funktion utan att dissekera muskeln, och därmed utan att behöva avliva djuret under studien. Vår specialdesignade skada modell (patentsökt) baseras på samma principer som används av andra för att upprätta kontraktion-inducerade skador på djur ^5,12,15,24. Trots att det finns modellerna på marknaden, det finns lite instruktioner bortom användning av hårdvara. Vår modell har specifikationer i form av tillgängligt utbud av rörelse och vinkelhastigheten som är fördelaktiga ^17, men vårt huvudsakliga mål är att dela med de metoder, vi har försökt att beskriva rutiner från början till slut för att producera en skada. Fördelar med in vivo modellen är att den muskeln, anatomi och biomekanik inte ändras och att förfarandet inte är terminalen. Vi använder samma plats i skenbenet för alla moment mätningar, efter sanitära rutiner och med en steril nål för varje mätning. Benet kan stabiliseras utan användning av en transosseus stift, men vi har hittat stiftet sig vara överlägsen i fråga om tillförlitlighet och eliminera främmande rörelse under förlänga värkarna.

Den apparat som används för in vivo vridmoment mätningar har flera andra fördelar. Det innebär ingen dissektion, så det finns ingen anledning att avliva djuret under studien. Resultatet är att man kan mäta kontraktilitet i samma djur över tid och / eller med in vivo imaging, såsom MRT. Andra fördelar är att normala anatomi inte ändras, är nerven inte kringgås för stimulering (som för in vitro-preparat), och de muskler kvar i sin normala miljö, så effekterna av inflammation, hormoner eller andra faktorer kan studeras. Eftersom det kräver användning av färre djur, vars muskler utsätts för färre manipulationer (t ex dissektion före analys av funktion), föredrar vi att använda vridmoment mätningar när det är möjligt. I samma ögonblick arm musen TA är känt ⁴ och muskeln kan vägas när djuret offras. Det finns vissa begränsningar dock, jämfört med att isolera muskeln. Till exempel är det svårt att veta den exakta längden förändringar som sker under förlängning sammandragningar och muskelmassa kan inte mätas förrän den skördas (även om det kan beräknas baserat på volymen mäts via MRT) ^8.

För att fastställa "särskilda kraft" (force per tvärsnittsarea) för en enskild muskel, behov som muskler kan isoleras och placeras på rätt sätt, vilket även undviker kraftöverföring från närliggande muskler ^10. In situ apparaten var avsedd för detta ändamål. Det ger ett alternativ för att mäta kontraktilitet av endast en muskel med en känd längd och massa. Men denna metod har också begränsningar. Även in situ apparaten ger mer experimentell kontroll vid mätning av kraft för en enskild muskel, är avvägningen att experimentet blir mindre fysiologiska. In situ kraft mätningar kräver ett kirurgiskt version av TA-muskeln, som kan förändra anatomi och påverka kraftöverföring. Experimentet är också terminal, så att muskeln inte kan följas över tid.

Diffusion tensor imaging (DTI) är potentiellt en ännu mer känslig och tidigare markör för muskelskada än standard T2-viktad MRT. De variabler erhålls med DTI, åtminstone i andra vävnader såsom hjärna (1), visar en stark och snabb reaktion på skada, medan T2 signal kan ta en längre tid till förändring. DTI är baserad på mätning av uppenbara diffusion av vatten i vävnader. DTI Tekniken har jämförts med faktiska längdsnitts av råttan TA och det har visat sig att DTI riktningar faktiskt representerar lokala anvisningar muskelfiber i råtta TA muskeln ^19.

MRS ger information om den kemiska sammansättningen av muskler icke-invasivt ^12. Beroende på de observerade kärnan, gör MRS observation av högenergetiska fosfater ⁽³¹ P MRS) eller lipider ⁽¹ H MRS). ³¹ P MRS är ett idealiskt verktyg för undersökning av muskel metabolism, eftersom det är icke-invasiv och kan enkelt tillämpas på in vivo-studier av skelettmuskulaturen. Alternativa metoder för biokemisk analys av in situ muskler metaboliter, såsom nål biopsi, kan ge betydande överskattningar av Pi och uppenbara minskningar av PCR ^1. En djurmodell ger uppenbara fördelen med att använda en kontrollerad skada och jämföra in vivo MRS förändringar fynd i biokemi, morfologi och funktion av vävnad. Förändringar i högenergetiska fosfatmetabolismen förekommer i sjukdomar som leder till muskulär degeneration ^2,20. Intracellulära pH, samt MR-signalen nyckeltal intensitet Pi / PCR (oorganiskt fosfat [Pi] till phosphocreatine [PCr]) och PDE / PCR (phosphodiester [PDE] till PCR), kan ge värdefull information om scenen och svårighetsgraden av degeneration.