The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
1Department of Physiology, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Orthopaedics, University of Maryland School of Medicine, 3Department of Diagnostic Radiology, University of Maryland School of Medicine
This article is a part of JoVE Clinical and Translational Medicine. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
Current Access Through Your Registered Email Address
Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery. J. Vis. Exp. (51), e2782, doi:10.3791/2782 (2011).
זנים שרירים הם אחת התלונות הנפוצות ביותר שטופלו על ידי רופאים. פציעה בשריר מאובחנת בדרך כלל מן ההיסטוריה המטופל בדיקה גופנית בלבד, אולם את המצגת קליני יכול להשתנות במידה רבה בהתאם למידת הפגיעה, סובלנות הכאב של החולה, וכו 'בחולים עם פגיעה בשריר או מחלות שרירים, הערכת נזק השריר מוגבל בדרך כלל סימנים קליניים, כגון, טווח רגישות, כוחה של תנועה, ולאחרונה, מחקרי הדמיה. סמנים ביולוגיים, כגון רמות קריאטין קינאז בדם, גבוהות בדרך כלל עם פגיעה בשרירים, אבל רמות שלהם לא תמיד מתואמים עם הפסד של ייצור כוח. הדבר נכון גם ממצאים היסטולוגית מבעלי חיים, המספקים "למדוד ישיר" של נזק, אך אינם אחראים לאובדן כל פונקציה. חלקם טענו כי המדד המקיף ביותר לבריאות הכללית של שריר בכוח התכווצות. בגלל פציעה בשריר הוא אירוע אקראי המתרחשת תחת מגוון של תנאים ביומכנית, קשה ללמוד. כאן אנו מתארים במודל בבעלי חיים vivo למדוד מומנט ו לייצר לפגיעה בשרירים אמין. כמו כן, אנו מתארים מודל שלנו למדידת כוח מן השריר מבודד באתרם. יתר על כן, אנו מתארים הליך חיה MRI קטן שלנו.
1. במודל vivo פציעה ומדידה של מומנט איזומטרי.
2. במדידה באתרו של מתח שרירים כולו.
3. In vivo MR הדמיה ו / או ספקטרוסקופיה של שרירי השלד מכרסם.
כל ה-MRI ו - MRS מבוצע על Biospin Bruker (Billerica, MA) 7.0 טסלה מערכת MR מצויד להכניס 12 ס"מ שיפוע (660 MT / מ 'לכל היותר שיפוע, 4570 T / m / s שיעור ברכה מרבי) מפעיל תוכנה פאראוויזיון 5.0.
4. מסיק ואחסון השרירים.
TAS נקצרים לאחר בסוף הניסויים, שקל, הצמד מוקפאת בחנקן נוזלי, ואז מאוחסן ב -80 ° C. זה יכול להתבצע בכל נקודת זמן לאחר בניסויים vivo. השרירים נקצרים מיד לאחר בניסויים באתרו, כפי שמדובר בהליך סופנית. עבור מחקרים מורפולוגיים מפורטת, חיה הוא קבוע עם paraformaldehyde 4% באמצעות זלוף דרך החדר השמאלי.
5. נציג תוצאות.
איור 3 מציג נתונים נציג חולדה ב במנגנון vivo המנגנון in vivo משמש להשגת מומנט מרבי שנוצר על ידי השרירים dorsiflexor;. הוא משמש גם כדי לגרום לפגיעה בשרירים הללו זהה. בשל היחסים אורך המתח של השריר, מומנט מרבי איזומטרי מתרחש בדרך כלל כאשר מפרק הקרסול ממוקם על כ 20 מעלות של plantarflexion (עם רגל ממוצבת אורתוגונליים אל השוקה נחשב 0 °). לאחר מומנט איזומטרי מקסימלי מתקבל, רגל אז יכול להיות ממוקם בתנוחה כלשהי כדי להתחיל את פרוטוקול פציעה. איור 3 מייצג פרוטוקול ולפציעתם של 30 חזרות עם קשת של תנועה בין 0 ° - 70 °. הערה ירידה מתמדת המומנט שנוצר בשלב איזומטרי (החץ מלא) לבין שלב התארכות (חץ פתוח) במהלך הפרוטוקול, התכווצות המושרה פציעה. מומנט נרשם ביחידות של המוזיאון, אבל את הערך המוחלט תלוי בגודל של החיה והמצב שלה (למשל, שריר פגועים, עייפות שרירים, או שריר חסר חלבון מסוים עקב רקומבינציה הומולוגיים).
איור 4 מראה נתונים נציג חולדה ב במנגנון באתרה. שלנו במנגנון באתרו אינו כרוך התכווצויות התארכות, אלא מאפשר לנו לבודד, כמו שצריך ליישר, ולמדוד את המתח המקסימלי המיוצר על ידי שרירים בודדים באורך ידוע. איור 4 מראה את האובדן ההדרגתי של כוח המתרחשת במהלך מבחן עייפות בשריר הקדמי tibialis של חולדה. בדוגמה זו בפרט, התכווצויות titanic בוצעו פעם בכל שנייה במשך 5 דקות. המתח (הכוח) נרשם בדרך כלל ניוטונים (או גרם), אבל כמו מומנט, את הערך המוחלט תלוי בגודל ומצבו של החיה. בגלל משקל שריר מתקבל מיד לאחר הליך זה, כוח יכול להיות מנורמל (המכונה "כוח ספציפי") לאזור שריר לחצות המודולרית.
איור 5 מציג נתונים נציג בתחום ההדמיה vivo של עכבר, כגון מיפוי פרמטרית T1 ו-T2 משוקלל (א), tractography 3D של דימות מותח דיפוזי (ב '), 1 H ספקטרוסקופיה (ג), ו - 31 ספקטרוסקופיה P. פרטים ניתנים במקרא הדמות.

איור 1: במנגנון vivo .* כדי לייצר את הפגיעה, את עצם השוק הוא התייצב רגל המצורפת צלחת המנוע מונע. Dorsiflexors הקרסול הם גירוי דרך עצב שוקיתי בעוד אדן כוחות כף הרגל אל תוך כיפוף plantar (חץ מקווקו).
* Lovering & דה Deyne, ביומכניקה J 2005, בשימוש באישורו.

איור 2: במנגנון באתרו תא העומס הוא רכוב על micromanipulator כך ת"א, יכול להיות מותאם אורך מנוחה מיושר כראוי את X, Y ו-Z כיוונים. הגיד הדיסטלי של ת"א מחובר לתא עומס עוויתות יחיד המושרה על אורכי שריר שונים על מנת לקבוע L 0. התכווצות tetanic המקסימלי מתקבל לקבוע הפעלה התכווצות מקסימאלית (P 0). המתח tetanic מקסימלי ניתן לבצע שוב ושוב מבוטא כאחוז של P 0, מתן אינדקס של עייפות בנקודה הרצויה בזמן.
782/2782fig3.jpg "alt =" איור 3 "/>
איור 3: נתונים מתוך מומנט ב נציג vivo מנגנון הקלטות שמץ של מומנט של התארכות התכווצויות בחולדה. בדוגמה זו בפרט, השרירים היו מגורה עבור 200 אלפיות השנייה כדי לעורר התכווצות איזומטרי שיא (חץ מלא) לפני הארכה (חץ פתוח) על ידי אדן באמצעות קשת 70 מעלות של תנועה במהירות זוויתי של 900 ° / s.

איור 4: נתונים מן המתח באתרו נציג נתונים מנגנון מראה את ירידת המתח מקסימלי tetanic איזומטרי במהלך גירוי חוזרות ונשנות של שריר קדמי tibialis (ת"א) ב עכברוש. בדוגמה זו, ת"א היתה מבודדת, מותאמים אופטימלית אורך (L 0), ועורר אז עם התכווצות 200 tetanic ms פעם בכל שנייה במשך 5 דקות.

איור 5: in vivo הדמיה: התמונות מראות רוחבי (צירית) חלקים של מיפוי פרמטרית T1 ו-T2 משוקלל של השריר הקדמי tibialis (ת"א). תיבת אדום מנוקד המקיף את ת"א להראות גדל גדל ב T2 הפצועים (צד שמאל) לעומת (צד ימין) וללא כל פגע ב ':.. Tractography 3D נציגת דימות מותח דיפוזי (DTI) C: הספקטרום 1 H של ת"א עכבר מראה מספר תהודות שומנים בדם לזיהוי; הבחנה בין intramyocellular (IMCL) ואת השומנים extramyocellular (EMCL) פסגות מתקבל באמצעות שיטה זו D: 31 P ספקטרום MR של ת"א מציג את החולדה phosphocreatine (PCR), פוספטים אנאורגניים (PI), ושלושת. תהודות (α, β, γ) של אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
"נזק לשרירים" הוגדר נמדד בדרכים רבות. פגיעה מבנית ניכרת הממצאים היסטולוגית 6,9, אבל בעיה אחת עם רבים של סמנים ביולוגיים להערכת לפגיעה בשרירים, כולל אלה המשמשים במחקרים בבעלי חיים, היא שהם בדרך כלל לא לתאם עם אובדן כוח. נזק לשרירים מוגדרת לעתים קרובות בהקשר של assay נהגו לבחון אותו ולא למצוא אחד יכול להסביר את השינויים contractility לאחר פציעה. מאז פונקציה כויץ מלא יכול להימשך למרות נוכחותם של סמנים פציעה, אובדן כוח יכול להיות תקף למדוד ביותר של פגיעה 3, וכנראה הרלוונטי ביותר.
קשה ללמוד פציעות שרירים בבני אדם, כמו שכיחות היא אירוע מקרי, כי קשה לחזות את המצגת הקליני משתנה מאוד. לכן הרבה של הנתונים על פגיעות שריר כבר הוברר ממחקרים על בעלי חיים, אשר מספק שליטה על משתנים רבים והיכולת ללמוד מנגנוני פציעה והתאוששות. המנגנון לפגיעה vivo שתיארנו מספק שיטה להערכת תפקוד כויץ בלי לנתח את השריר, ובכך ללא צורך להרדימו תחת מחקר. מודל אישית מעוצבת שלנו פציעה (פטנט) מבוססת על אותם עקרונות בשימוש על ידי אחרים כדי לבסס את התכווצות-Induced פגיעה בבעלי חיים 5,12,15,24. למרות הזמינות של דגמים בשוק, יש הדרכה קצת מעבר לשימוש של החומרה. במודל שלנו יש מפרטים במונחים של טווח זמין תנועה ומהירות זוויתית כי הם יתרון 17, אבל המטרה העיקרית שלנו היא לחלוק את שיטות, יש לנו ניסה לתאר הליכים מתחילתו ועד סופו לייצור פציעה. היתרונות של מודל vivo הן כי השריר, אנטומיה ביומכניקה אינן משתנות, כי הנוהל אינו סופני. אנחנו משתמשים במיקום זהה השוקה עבור כל המדידות מומנט, בעקבות הליכים סניטריים באמצעות מחט סטרילית לכל מדידה. הרגל יכול להיות מיוצב ללא שימוש סיכה transosseus, אבל מצאנו את הסיכה להיות מעולה מבחינת אמינות ביטול תנועת זרים במהלך הצירים מתארכים.
המנגנון המשמש במדידות מומנט vivo יש יתרונות נוספים רבים. זה לא קשור כל דיסקציה, ולכן אין צורך להרדימו תחת מחקר. התוצאה היא, כי ניתן למדוד contractility בעלי חיים זהה לאורך זמן, ו / או עם vivo הדמיה כגון MRI. יתרונות נוספים הם כי אנטומיה נורמלית לא משתנה, העצב הוא לא עקף לגירוי (כגון בהכנות חוץ גופית), ואת השריר נשאר בסביבה רגילה, כך ההשפעות של דלקת, הורמונים, או גורמים אחרים ניתן ללמוד. כי זה דורש את השימוש בבעלי חיים פחות, שאת השרירים חשופים למניפולציות פחות (למשל, דיסקציה לפני assay של הפונקציה), אנו מעדיפים להשתמש מדידות מומנט במידת האפשר. הזרוע רגע של ת"א עכבר ידוע 4 ואת השרירים ניתן לשקול כאשר החיה הוא הקריב. ישנן מספר מגבלות עם זאת, בהשוואה ל לבודד את השריר. לדוגמה, קשה לדעת את השינויים באורך המדויק המתרחשות במהלך הצירים מתארכים, ואת מסת שריר לא ניתן למדוד עד שהוא שנקטפו (למרות שזה יכול להיות מוערך על בסיס נפח שנמדד באמצעות MRI) 8.
כדי לקבוע את "כוח ספציפי" (כוח ליחידת שטח חתך צלב) של שריר אדם, שריר זה צריך להיות מבודדים וממוקמים כראוי, זה גם ימנע העברת כוח מן השרירים הסמוכים 10. במנגנון באתרו נועד למטרה זו. הוא מספק אלטרנטיבה למדידת contractility של שריר אחד בלבד עם אורך ידוע המונית. אולם שיטה זו גם יש מגבלות. למרות במנגנון באתרו מספק שליטה ניסיוני יותר כאשר מודדים את הכוח של השריר הפרט, trade-off היא כי הניסוי נעשה פחות פיזיולוגית. במדידות כוח באתרו דורשים שחרור כירורגי של השריר ת"א, אשר יכול לשנות את האנטומיה ולהשפיע כוח השידור. הניסוי הוא גם סופני, כך שריר לא יכול להיות במעקב לאורך זמן.
דימות מותח דיפוזי (DTI) הוא פוטנציאל סמן רגיש אפילו יותר מוקדם של נזק לשריר מאשר תקן T2 משוקלל MRI. המשתנים שהושגו עם DTI, לפחות ברקמות אחרות כגון המוח (1), להראות תגובה חזקה ומהירה לנזק, ואילו האות T2 יכול לקחת תקופה ארוכה כדי לשנות. DTI מבוסס על מדידת דיפוזיה, לכאורה, של מים ברקמות. הטכניקה DTI הושווה סעיף האורך בפועלים של ת"א את העכברוש וזה הוכח כי כיוונים DTI בעצם מייצגים המקומית סיבי השריר הכיוונים החולדה ת"א שריר 19.
MRS מספק מידע על ההרכב הכימי של השריר הלא פולשני 12. בהתאם הגרעין הנצפה, גברת מאפשר תצפית של אנרגיה גבוהה פוספטים (31 P MRS) או שומנים (1 H MRS). MRS 31 P הוא כלי אידיאלי עבור החקירה של מטבוליזם השריר כי זה אינו פולשני וניתן בקלות להחיל במחקרים vivo של שרירי השלד. גישות חלופיות assay ביוכימיים של מטבוליטים של שריר באתרו, כגון ביופסיה מחט, יכול לתת מגזים משמעותי של הפחתות Pi ו לכאורה של PCR 1. מודל החיה מספקת את היתרון הברור של שימוש פציעה מבוקר ומשווה לשינויים vivo גברת לממצאים בביוכימיה, מורפולוגיה, והתפקוד של רקמות. שינויים במטבוליזם של אנרגיה גבוהה פוספט הם נתקלו במחלות ניוון שרירים המוביל 2,20. PH תאיים, כמו גם את עוצמת האות יחסי MR Pi / PCR (אורגניים פוספט [Pi] כדי phosphocreatine [PCR]), ו PDE / PCR (phosphodiester [PDE] כדי PCR), עשוי לספק מידע יקר ערך לגבי השלב וחומרת ניוון שרירים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
המחברים מבקשים להודות לד"ר רוברט בלוך, במימונם הנדיב של מעבדת החלל שלו ומתקני וד"ר ראו Gullapalli ועל דא שי בליבת עבור הדמיה Translational ב מרילנד (C-TRIM) ואת המחקר תהודה מגנטית מרכז (MRRC) לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים RML מן המכונים הלאומיים לבריאות (K01AR053235 ו 1R01AR059179) ומן ניוון שרירים האגודה (# 4278), ועל ידי מענק מהקרן JAR Jain.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| All equipment is the same for mice and rats except for the footplate | |||
| BUD Value Line Cabinet | Newark Inc | 06M4718 | |
| Multifunction l/O USB-6221M | National Instruments | 779808-01 | |
| Stepper motor controller | Newark Inc | 16M4189 | |
| Stepper Motor | Newark Inc | 16M4198 | |
| Strain Gauge Amplifier | Honeywell | DV-05 | |
| Torque Sensor | Honeywell | QWLC-8M | |
| Foot plate and stabilization device (custom made, patent pending) | |||
1
ReplyPosted by: Kevin M.January 26, 2012, 10:55 AM