Un In vivo Modelo de roedores de la contracción inducida por la lesión y la monitorización no invasiva de la recuperación

1. Modelo in vivo de lesiones y la medición del torque isométrico.

1. Estos procedimientos se pueden utilizar para ratas o ratones ^7,17,18. Para comenzar, coloque en posición supina animal bajo anestesia por inhalación (~ 4-5% isoflurano para la inducción de una cámara de inducción, entonces ~ 2% isoflurano a través de una ojiva de mantenimiento), utilizando un vaporizador de precisión (cat # 91103, Vet Equip, Inc., Pleasanton , CA). Aplicar la crema oftálmica estéril (pomada Paralube Vet, PharmaDerm, Floham Park, NJ) para cada ojo para proteger la córnea se seque. Durante el procedimiento, el animal se mantiene caliente por el uso de una lámpara de calor colocado fuera de la jaula y mantenerse al menos a 6 pulgadas del animal en todo momento.
2. Preparación de la piel mediante la eliminación de cabello y la limpieza con la alternancia de matorrales de Betadine y alcohol al 70% para evitar que las bacterias siembra la piel dentro del tejido blando o hueso. Confirmar la anestesia adecuada por la falta de un reflejo del tendón profundo (no el retiro del pie en respuesta a pellizcar el pie). Una aguja se colocan manualmente a través de la tibia proximal con el fin de estabilizar la extremidad en el equipo (25G o 27G para el ratón). La aguja no debe entrar en el compartimento anterior de la pierna.
3. Bloqueo de la aguja en una posición fija, de tal manera que el animal está en posición supina y los dedos están mirando hacia arriba. Un dispositivo de medida se utiliza para proteger la aguja y así estabilizar la pierna.
4. Coloque el pie de la extremidad en un reposapiés a medida mecanizado (Figura 1). El eje de la placa base está conectada a un motor paso a paso (modelo T8904, NMB Technologies, Chatsworth, CA) y un sensor de torque (modelo QWFK-8M, Sensotec, Columbus, OH). El pie debe ser, inicialmente alineados de tal forma que es perpendicular a la tibia, como en la figura 1.
5. Use electrodos transcutánea (723.742, Harvard Apparatus, Cambridge, MA) o electrodos subcutáneos (J05 agujas de los electrodos de aguja, 36BTP, Jari suministro de electrodos, Gilroy, CA) para estimular el nervio peroneo cerca del cuello del peroné, donde el nervio se encuentra en una posición superficial. Confirmar visualmente dorsiflexión aislada mediante la realización de una serie de convulsiones (0,1 ms de pulso para el ratón y un pulso ms de la rata) antes que el pie está asegurada. Una vez que el pie se fija a la placa con cinta adhesiva, un incremento en la amplitud de contracción en respuesta a un aumento de la tensión confirma que los músculos opuestos (flexores plantares) no están siendo estimulados simultáneamente.
6. Antes de la lesión, y en los puntos de tiempo seleccionado después de una lesión, la fuerza máxima capacidad de producción de los flexores dorsales se registra como la "par isométrica máxima" (par, sin un cambio en la longitud muscular). Mediciones de torque se realizan en la misma plataforma que se utiliza para inducir la lesión. Antes de grabar par isométrica máxima, la amplitud del pulso se ajusta para optimizar la tensión nerviosa y la posición óptima del tobillo está determinada por dar tirones en diferentes longitudes de los flexores dorsales. Después de obtener una curva de par-ángulo para determinar la duración óptima de la dorsiflexores (longitud de reposo, también conocido como Lo), una parcela de frecuencia par se obtiene aumentando progresivamente la frecuencia de los pulsos en un tren de pulsos de 200 ms. A la máxima contracción tetánica fusionado se obtiene generalmente a 90-100 Hz. Tres contracciones por separado y contracciones tetánicas son grabadas y guardadas para su posterior análisis.
7. El uso de software comercial de (Labview versión 8.5, National Instruments, Austin, TX) para sincronizar la activación contráctil, el inicio de la rotación del tobillo, y la recopilación de datos de par. La estimulación de los músculos flexores dorsales se produce mientras el motor controlado por ordenador al mismo tiempo mueve la platina en la flexión plantar, lo que conduce a una contracción de alargamiento (también llamado "excéntrico" contracción, lo que provoca una lesión del músculo). El protocolo específico depende de la magnitud deseada de la lesión deseada por el investigador. La magnitud de la lesión o daño a los tejidos, puede ser regulada por la manipulación de variables como la velocidad angular, el momento de la activación muscular, el rango de movimiento, y el número de las contracciones de alargamiento.
8. Para inducir la lesión, superponer una contracción de alargamiento en una contracción isométrica máxima, la variación de la amplitud de movimiento, la velocidad de alargamiento, y el momento de la estimulación, según sea necesario. Por ejemplo, una contracción isométrica máxima se obtiene en los flexores dorsales y después de 200 ms que se alargan a una velocidad seleccionada con el movimiento normal de aproximadamente (900 ° / seg). Hemos demostrado anteriormente que la activación antes de que el movimiento y el grado de alargamiento son factores importantes en la obtención de una lesión ^14. La mayoría de los par producido por el dorsiflexores es de la TA ¹¹ y hemos demostrado previamente que este modelo resulte en una lesión de este músculo ^5,13-15. La asistencia técnica sigue siendo estimulados a través de alargamiento.
9. Después de la lesión, el animal se retira del aparato. El pasador de la tibiaeliminado, la pierna se limpia una vez más, y el animal es devuelto a la jaula (que se encuentra en un bloque de calentamiento con temperatura controlada a 37 ° C) y monitoreado hasta su recuperación. Esto incluye tanto la espera hasta que el animal está despierto y móviles. Los animales no sufren ningún dolor observable durante el procedimiento y no hay cambios visibles en la marcha (cojera, por ejemplo) después de una lesión inducida por las contracciones de alargamiento. Sin embargo, los medicamentos adecuados contra el dolor, el tratamiento se administra posteriormente (buprenorfina 0,05 a 0,1 mg / kg cada 12 horas durante 48 horas después de la cirugía).

2. En la medición in situ de toda la tensión muscular.

1. El animal se prepara y se estabiliza la tibia como se describió anteriormente en la sección 1.1 a la 1.3. Todos los instrumentos se enciende al menos 30 minutos antes de la prueba para la calibración correcta y minimizar la deriva térmica del transductor de fuerza.
2. Incisión en la piel anterior del tobillo y cortar el tendón del músculo tibial anterior (TA). Cuidadosamente empate 4,0 Ethicon seda sutura no absorbible en el tendón y adjuntar la sutura vicryl a la celda de carga a través de la siempre gancho en S (peso = 0,1 g), el modelo FT03, Grass Instruments, Warwick, RI). Por otra parte, una pinza de medida (peso = 0,5 g) se puede utilizar para fijar el tendón de la sutura vicryl (Figura 2).
3. La célula de carga se monta en un micromanipulador (Manipulador Kite, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL) para que la asistencia técnica se podría ajustar a la longitud de reposo y alineado (en línea recta de la tensión entre el origen y la inserción). La asistencia técnica está protegida por el enfriamiento de una lámpara de calor y de la deshidratación por aceite mineral. Las señales de la célula de carga (calibrado antes de cada prueba) se alimentan a través de un amplificador de CC (modelo P122, Grass Instruments, Warwick, RI) a un A / D bordo para ser recogidos y almacenados por el software de adquisición (PolyView la versión 2.1, Grass Instruments , Warwick, RI).
4. Coloque la asistencia técnica a la célula de carga y aplicar tics simples (pulso rectangular de 1 ms) a diferentes longitudes de los músculos con el fin de determinar L _0. La longitud del músculo en reposo, medido con pinzas, se define como la distancia entre la tuberosidad tibial y la unión miotendinosa. En esta longitud, aumentar gradualmente la amplitud del pulso y la frecuencia de pulso para establecer una relación fuerza-frecuencia. Una contracción tetánica fusionado máximo se obtiene en aproximadamente el 90-100Hz (300 ms duración tren compuesto de 0,1 ms y 1 ms pulsos). El uso del 150% de la intensidad de la estimulación máxima para activar la asistencia técnica con el fin de inducir la activación contráctil máxima (P _0). Máxima contracciones tetánicas se puede realizar en repetidas ocasiones y se expresó como porcentaje de P _0, proporcionando un índice de fatiga en cualquier punto deseado en el tiempo.

3. Vivo en la RM y / o espectroscopia de los músculos esqueléticos de roedores.

Todos los MRI y MRS se realiza en una BioSpin Bruker (Boston, MA) 7,0 Tesla MR sistema equipado con un inserto de 12 cm de gradiente (660 Tm / m máximo gradiente, 4570 T / m / s de velocidad de giro máximo) que se ejecuta Paravision software 5.0.

1. El animal se anestesia con isoflurano vaporizado como se describe en 1.1. Un sistema MR-compatible de pequeños animales de vigilancia y gating (SA Instruments, Inc.) se utiliza para controlar el ritmo respiratorio y temperatura corporal. La temperatura del cuerpo del ratón se mantiene a 36-37 ° C con una circulación de agua caliente. El titular de medida se utiliza para colocar el ratón en la posición supina con las piernas paralelas a la cavidad del imán de la rodilla al pie. Un niño de cuatro canales de sólo recepción bobina de superficie se coloca dentro de un 1H 72 mm resonador lineal. La bobina del resonador se ajusta y se adecuen a la muestra.
2. Resonancia magnética: Después de los localizadores, los siguientes RM se realizan: T1 rápida adquisición con el mejoramiento de la relajación (RARE) con los siguientes parámetros: TE = 9,52 ms, TR = 1800, el eco del tren longitud = 4, en el plano resolución de 100x100 m y grosor de corte = 750 micras. Doble eco PD/T2 RARE: TE = 19.0/57.1 ms, TR = 5000 ms, tiempo de eco tren = 4, en el plano resolución de 100x100 m, y un grosor de corte = 750 micras. Spin eco (SE) la difusión de datos tensor de la imagen con 12 personas que no colineales direcciones: b-valor = 350 s / mm ^-2, TE = 26 ms, TR = 4500 ms, en el plano de resolución 150x150 m, y el grosor de corte = 750 m . Multicorte multi-eco (MIPYME) T2 datos de los mapas paramétricos utilizando 16 TE = 11,4 ms a 182,5 ms con ΔTE = espesor de 11,4 ms, TR = 10000 ms, en el plano de resolución 150x150 m, y el tramo = 750 micras.
3. Procesamiento de imágenes: la reconstrucción tensor de difusión y se realiza mediante tractografía TrackVis (Martino Centro de Imágenes Biomédicas, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA) para crear la difusividad media (DM), la fracción imágenes anisotropía (FA), así como mapas tractografía. Mapeo T2 se realiza utilizando software personalizado por escrito en el MAT LAB (The Mathworks, Natick, MA), utilizando no lineal de mínimos cuadrados para ajustar los datos medidos en cada píxel de la ecuación de la señal T2 canónica. Regiones de interés son las mediciones realizadas para evaluar los valores de parámetros dentro de la TA.
4. 1H espectroscopia calce automático se realiza en una 1 x 1 x 4 mm ³ voxel en el TA. A punto de resolverse la espectroscopia (PRESS) secuencia de pulsos (TR / TE = 2000/18 ms) se utiliza para obtener los espectros de la misma voxel de 1024 los promedios. Adquisición de datos es de 34 minutos en cada pierna. Los datos espectrales se procesan utilizando el paquete de ¹⁶ LCModel. 31P espectroscopia: Un doble sintonizado (1H, 31P) bobina de superficie se utiliza para realizar no localizados (mediante un único experimento de pulso) o espectroscopia localizada con la imagen seleccionada en vivo espectroscopia (ISIS) secuencia de pulsos.

4. Recolección y almacenamiento de los músculos.

TA se cosechan después de la final de los experimentos, se pesa, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C. Esto se puede realizar en cualquier momento después de los experimentos in vivo. Los músculos se cosechan inmediatamente después de los experimentos in situ, ya que este es un procedimiento terminal. Para estudios morfológicos detallados, el animal se fija con paraformaldehído al 4% a través de la perfusión a través del ventrículo izquierdo.

5. Los resultados representativos.

La Figura 3 muestra los datos representativos de una rata en el aparato en vivo El aparato in vivo se utiliza para obtener el par máximo generado por los músculos flexores dorsales;. También se utiliza para inducir lesiones en estos mismos músculos. Debido a la relación longitud-tensión de los músculos, el par isométrica máxima se produce normalmente cuando la articulación del tobillo está situado aproximadamente a 20 º de flexión plantar (con el pie colocado perpendicular a la tibia considera 0 °). Después de par de torsión isométrica máxima se obtiene, el pie se puede colocar en cualquier posición para iniciar el protocolo de lesión. La figura 3 representa un protocolo de lesión de 30 repeticiones con un arco de movimiento de 0 ° - 70 °. Tenga en cuenta la constante disminución del par generado a partir de la fase isométrica (flecha llena) y la fase de alargamiento (flecha abierta) durante la contracción inducida por el protocolo de lesión. El par se registran en las unidades de NMM, pero el valor absoluto depende del tamaño del animal y su condición (por ejemplo, el músculo lesionado, los músculos fatigados, o de los músculos carecen de una proteína determinada, debido a la recombinación homóloga).

La Figura 4 muestra los datos representativos de una rata en el en el aparato in situ. Nuestro aparato in situ no implica alargar las contracciones, sino que nos permite aislar, alinear correctamente, y medir la tensión máxima producida por un músculo individual en una longitud conocida. La Figura 4 muestra la pérdida gradual de la fuerza que se produce durante un ensayo de fatiga en el músculo tibial anterior de una rata. En este ejemplo en particular, las contracciones del Titanic se realizaron una vez por segundo durante 5 minutos. Tensión (fuerza) es normalmente registrada en Newtons (o gramos), pero como el par, el valor absoluto depende del tamaño y la condición del animal. Dado que el peso muscular se obtiene inmediatamente después de este procedimiento, la fuerza puede ser normalizado (llamada "fuerza específica") en el músculo área transversal.

La Figura 5 muestra datos representativos de imágenes in vivo de un ratón, como el mapeo paramétrico en T1 y T2 (A), tractografía 3D a partir de imágenes por tensor de difusión (B), ¹ H espectroscopia (C), y ^{31 de} la espectroscopia P. Los detalles figuran en la leyenda de la figura.

Figura 1: en el aparato vivo .* Para producir la lesión, se estabiliza la tibia y el pie unido a una placa de motor. El dorsiflexores tobillo son estimulados a través del nervio peroneo, mientras que las fuerzas de la placa base del pie en flexión plantar (flecha punteada).
* Lovering y Deyne De, Biomecánica J de 2005, se utiliza con permiso.

Figura 2: En el aparato in situ de la célula de carga se monta en un micromanipulador para que la asistencia técnica se podría ajustar a la longitud de reposo y alineado correctamente en la X, Y, y Z. El tendón distal de la asistencia técnica se une a la célula de carga y tics simples son inducidos a diferentes longitudes de los músculos con el fin de determinar L _0. Una contracción tetánica máxima se obtiene para determinar la activación contráctil máxima (P _0). La tensión tetánica máxima se puede realizar en repetidas ocasiones y se expresó como porcentaje de P _0, proporcionando un índice de fatiga en un punto determinado en el tiempo.

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Figura 3: Los datos del par de grabaciones en vivo aparato de rastreo Representante del par de alargar las contracciones en la rata. En este ejemplo en particular, los músculos fueron estimulados durante 200 milisegundos para inducir una contracción máxima isométrica (flecha llena) antes de alargamiento (flecha abierta) en la placa base a través de un arco de 70 º de movimiento a una velocidad angular de 900 ° / s.

Figura 4: Los datos de la tensión de datos in situ aparato representativo que muestra la disminución de la tensión isométrica máxima tetánica durante la estimulación repetida del músculo tibial anterior (TA) en una rata. En este ejemplo, la TA fue aislado, ajustado a la longitud óptima (L _0), y luego estimulados con una contracción tetánica de 200 ms cada segundo durante 5 minutos.

Figura 5: imágenes in vivo A: Las imágenes muestran transversal (axial) secciones de mapeo paramétrico en T1 y T2 del músculo tibial anterior (TA). El cuadro rojo de puntos rodea a la asistencia técnica para mostrar un aumento mayor en T2 la lesión (izquierda) frente ileso (lado derecho) B:.. Tractografía Representante 3D a partir de tensor de difusión (DTI) C: El espectro de ¹ H de la TA del ratón muestra varias resonancias lípidos detectable; diferenciación entre intramiocelulares (IMCL) y los picos extramyocellular lípidos (EMCL) se obtiene con este método D: El ³¹ P espectro de RM de la TA rata muestra fosfocreatina (PCr), fosfato inorgánico (Pi), y los tres. resonancias (α, β, γ) de la adenosina 5'-trifosfato (ATP).

"El daño muscular" se ha definido y se mide de muchas maneras. El daño estructural es evidente en los hallazgos histológicos ^6,9, pero un problema con muchos de los marcadores biológicos utilizados para evaluar el daño muscular, incluyendo los que se utilizan en estudios con animales, es que por lo general no se correlacionan con la pérdida de la fuerza. El daño muscular se define a menudo en el contexto del ensayo utilizado para examinar y no encontrar uno puede dar cuenta de los cambios en la contractilidad después de la lesión. Dado que la función contráctil completo puede persistir a pesar de la presencia de marcadores de daño, pérdida de fuerza puede ser la medida más válida de la lesión ^3, y probablemente los más relevantes.

Es difícil de estudiar las lesiones musculares en los seres humanos, ya que la incidencia es un evento aleatorio que es difícil de predecir y la presentación clínica es muy variable. Por lo tanto, gran parte de los datos relativos a las lesiones musculares se han determinado a partir de estudios en animales, lo que permite controlar muchas variables y la capacidad de estudiar los mecanismos de lesión y la recuperación. El aparato en lesiones in vivo se ha descrito un método para evaluar la función contráctil, sin disección del músculo, y por lo tanto sin necesidad de sacrificar al animal en estudio. Nuestro diseño personalizado modelo de lesión (patente pendiente) se basa en los mismos principios utilizados por otros para establecer la contracción inducida por lesiones en los animales ^5,12,15,24. A pesar de la disponibilidad de modelos en el mercado, hay muy poca instrucción más allá del uso del hardware. Nuestro modelo tiene unas especificaciones en términos de rango de movimiento disponible y la velocidad angular que son ventajosas ^17, pero nuestro principal objetivo es compartir los métodos, hemos tratado de describir los procedimientos de principio a fin para la producción de una lesión. Beneficios del modelo in vivo es que el músculo, la anatomía y la biomecánica no sean alterados y que el procedimiento no es terminal. Usamos el mismo lugar en la tibia para todas las mediciones del par, después de los procedimientos sanitarios y el uso de una aguja estéril para cada medición. La pierna se puede estabilizar sin el uso de un alfiler transosseus, pero no hemos encontrado la clavija que es superior en términos de fiabilidad y eliminar el movimiento extraño durante las contracciones de alargamiento.

El aparato utilizado en las mediciones del torque vivo tiene varias ventajas adicionales. No implica ninguna disección, lo que no hay necesidad de sacrificar al animal en estudio. El resultado es que se puede medir la contractilidad en el mismo animal con el tiempo, y / o con imágenes in vivo, tales como resonancia magnética. Otras ventajas son que la anatomía normal no se ve alterada, el nervio no se pasa por alto para el estímulo (por ejemplo, en preparaciones in vitro), y el músculo permanece en su entorno habitual, por lo que los efectos de la inflamación, las hormonas y otros factores pueden ser estudiados. Debido a que requiere el uso de menos animales, cuyos músculos son sometidos a menos manipulaciones (por ejemplo, la disección antes del ensayo de la función), se prefiere usar las mediciones del par siempre que sea posible. El brazo de momento de la asistencia técnica que se conoce del ratón ⁴ y el músculo se puede pesar, cuando el animal es sacrificado. Hay algunas limitaciones sin embargo, en comparación con el aislamiento del músculo. Por ejemplo, es difícil conocer la longitud exacta de los cambios que se producen durante las contracciones de alargamiento, y la masa muscular no se puede medir hasta que se cosecha (aunque se puede estimar en base al volumen medido a través de resonancia magnética) ^8.

Para determinar la "fuerza específica" (fuerza por unidad de área transversal) de un músculo individual, que el músculo tiene que ser aislado y en la posición correcta, lo que también evita la transmisión de la fuerza de los músculos cercanos ^10. El aparato en situ se ha diseñado para este propósito. Supone una alternativa para la medición de la contractilidad de un solo músculo, con una longitud conocida y de masas. Sin embargo este método también tiene sus limitaciones. Aunque el aparato en situ proporciona un control más experimental en la medición de la fuerza de un músculo individual, la compensación es que el experimento se convierte en menos fisiológico. En las medidas de fuerza situ requiere una autorización quirúrgica del músculo TA, que pueden alterar la anatomía y afectar la fuerza de transmisión. El experimento también es terminal, por lo que el músculo no se puede controlar con el tiempo.

Tensor de difusión (DTI) es potencialmente un marcador más sensible y antes de daño muscular que el estándar en T2 de resonancia magnética. Las variables obtenidas con DTI, por lo menos en otros tejidos como el cerebro (1), muestran una respuesta fuerte y rápida a los daños, mientras que la señal T2 puede tomar un período prolongado para cambiar. DTI se basa en la medición de la difusión aparente del agua en los tejidos. La técnica de DTI ha sido comparada a la sección longitudinal reals de la asistencia técnica y la rata se ha demostrado que las direcciones locales del DTI en realidad representan direcciones de las fibras musculares en el músculo de ratas TA ^19.

MRS proporciona información sobre la composición química de los músculos de forma no invasiva ^12. Dependiendo del núcleo observado, MRS permite la observación de los fosfatos de alta energía ⁽³¹ P MRS) o lípidos ⁽¹ H MRS). ³¹ P MRS es una herramienta ideal para la investigación del metabolismo muscular, ya que no es invasiva y puede ser fácilmente aplicada a los estudios in vivo de los músculos esqueléticos. Enfoques alternativos para el análisis bioquímico de los metabolitos en músculo in situ, tales como la biopsia con aguja, puede dar una sobreestimación significativa de la reducción de Pi y aparente de PCR ^1. Un modelo animal proporciona la ventaja obvia de usar una lesión controlada y comparar los cambios en vivo MRS a los resultados de la bioquímica, la morfología y función del tejido. Los cambios en el metabolismo de fosfato de alta energía se encuentran en las enfermedades que conducen a la degeneración muscular ^2,20. PH intracelular, así como la relación de señal MR intensidad Pi / PCr (fosfato inorgánico [pi] en fosfocreatina [PCr]), y el PDE / PCr (fosfodiéster [PDE] para PCR), pueden proporcionar información valiosa acerca del nivel y la gravedad de la degeneración muscular.