到哺乳动物的上皮细胞在体外细菌粘附的含量

1。初步：菌株和上皮细胞。

无菌层流罩下进行细胞和细菌的操纵。

1. 新鲜分离的大肠杆菌大肠杆菌 2787，2787Δ 阿依达 ，和C600从甘油溶原性肉汤（LB）琼脂平板（1％蛋白胨，0.5％氯化钠，0.5％酵母提取物，1.5％琼脂）和成长在37 ° C。为了尽量减少检测的可变性，这是应始终使用新鲜镀株，并保持在4 ° C，在密封的Petri板最大的几个星期的菌株。
2. 文化HEp - 2细胞在高糖贝科的改良Eagle培养基（DMEM）（ATCC CCL - 23），辅以10％热灭活小牛血清（热灭活是在56℃30分钟）。在常规培养中，我们还添加了10 U / ml青霉素和10μg/ mL链霉素。
3. Hep - 2细胞增长在37 °与大气中含有5％的CO ₂细胞培养箱中的C。使用标准细胞培养过程，以维持细胞，这是生长在75厘米²瓶和传代培养，每次他们到达汇合。我们用我们的，直到他们达到30至40代的培养细胞，然后将它们丢弃。
4. HEp - 2细胞在75厘米²烧瓶时，几乎达到汇合，因此坚持实验的准备，准备一个试验。

2。第一天：准备接种和上皮细胞

1. 洗烧瓶中的HEP - 2细胞一旦与温暖的贝科的磷酸盐缓冲生理盐水（DPBS：8 g / L的氯化钠，0.2克/ L的KCl，0.2 g / L的KH ₂ PO _4，0.21 g / L的钠₂ HPO _{4：7H 2 O）}
2. 细胞培养与EDTA的0.05％胰蛋白酶 - 5分钟，然后加入新鲜温暖的完全培养基。添加新鲜培养基后，细胞悬浮吹打向上和向下。
3. 在5分钟2000转离心细胞悬液，并重新悬浮颗粒DPBS离心一次。
4. 辅以10％的血清，但没有抗生素，含有2 × ¹⁰ 5细胞/毫升的浓度在新鲜培养基重悬细胞。
5. 种子毫升细胞悬液三套复孔在24孔板中心（每一株），并在细胞培养孵化器，孵化盘一夜之间。
   注意：重要的是彻底decomplemented血清和抗生素后这个阶段省略。如果不这样做，可能会杀死细菌感染。
6. 接种5毫升LB培养基（1％蛋白胨，0.5％氯化钠，0.5％酵母提取物）在每个菌株的一个孤立的殖民地“（27872787Δ阿依达和C600）和成长一夜之间在37 °剧烈摇晃C（ 180 RPM ）。

3。第2天：细胞的感染

1. 检查HEp - 2细胞，倒置显微镜下，以确定他们至少有90％的融合，而不是污染。
2. 洗净，用温暖的DPBS，每口井的细胞，辅以10％血清的新鲜培养基中添加1毫升，但不含有抗生素。另外补充新鲜培养基三无细胞井。这将是用来确定每一株接种中的细菌总数。
3. 测量在600 nm（外径_0.600纳米 ）的细菌培养的光密度。每个细菌培养等分一套含有Hep - 2细胞中的重复井和一个不包含细胞。通常，我们使用了相应的10 ^6个菌落形成单位（CFU）过夜培养量。这代表了感染复数（MOI），以5:1（细菌细胞）。虽然我们直接使用我们的过夜培养，它有时是最好离心机的细菌和重悬在DPBS他们在一夜之间文化分泌的分子，以避免有害影响（如细胞毒素，例如）
   注：内政部可以100:1和1:10之间变化。高等教学语言的收益率更高的变异性和背景和细菌往往会坚持的塑料板。下的教学语言还具有高可变性。一旦MOI选择，当务之急是要一致，并保持这种教学语言。
4. 感染的细胞在细胞培养孵化器孵育3小时，在37℃，5％的_CO 2 。
   注：也有可能短暂离心板在低速（如1000 XG为1-2分钟），直接与细胞接触，以便使所有的细菌。这同步感染的增值收益，并允许更短的孵育时间（15-30分钟低至）。
5. 从被感染的细胞中取出，和洗脸用温水DPBS细胞的3倍。在这一步，附着细菌通常可以用一个标准的显微镜，我们经常执行此检查。
6. 裂解细胞分离坚持BACteria，加100μL1％Triton X - 100的的每个以及含有细胞。可以用其他洗涤剂（如例如皂甙）。
7. 为在室温下10分钟孵育细胞，然后加入900μLLB培养基。
8. 轻轻的同质化和重复吹打悬浮液。不含有细胞接种的水井也同样轻轻均匀。
   注：有些细菌可能是过于敏感，洗涤剂，在这种情况下，我们孵化上皮细胞分离与0.05％胰蛋白酶- 20分钟EDTA在37 ° C。坚持细菌细胞聚集，也可以用枪头井刮掉。
9. 准备坚持细菌和使用3稀释（通常为1:1,000，1:10,000和1:100,000稀释）的LB琼脂LB肉汤和板100μL接种悬浮系列10倍稀释，孵育过夜，于37 ° C 。

4。第3天：菌落计数和数据演示。

1. 计数板的殖民地和坚持细菌的接种人数计算，平均每个系列稀释的CFU。应该算只有10-300殖民地之间的板。

5。代表性的成果：

下表显示了典型的菌落计数坚持细菌接种在不同的日子进行了3个实验的结果：

结果可直接作为坚持CFU，如在图1A所示。由于接种的大小可以不同菌株之间由于增长率的差异或移液错误，它往往是最好的报告坚持细菌的百分比的结果。坚持细菌的百分比，可以计算的CFU的接种人数除以坚持细菌的CFU数量，如图1B所示。通过执行一个重复测量的方差分析和Bonferroni后测试比较图1B中的所有列，我们可以看到，有显着差异（P <0.05）之间的2787和2787Δ 阿依达 ，以及2787和C600之间，但无显着差异2787Δ 阿依达和C600之间。

图1 CFU坚持细菌（A）或（二）坚持细菌的百分比结果的代表性。

观察坚持的百分比往往是非常依赖对实验设置（以及在较小程度上，实验者）。尤其重要的是教学语言和清洗，这样的比例不应该从字面上解释。

有时在接种细菌可以增长速度远远比在细菌细胞的存在，比较真实的细菌总数与细胞井倾斜接种量的大小。为了缓解这一问题，建议两种：（i）使用与细胞井，以确定接种：HEp - 2细胞接种于附加以及和感染。在检测结束，而不是丢弃，上清，洗涤，100μL10％的Triton X - 100添加到井里。细胞裂解和裂解液含有细菌坚持和非粘贴轻轻反复向上和向下移液匀浆;或（ii）在实验结束收集感染的细胞培养上清，以及上清DPBS清洗并确定这些汇集上清对CFU。这将产生非坚持细菌的CFU数量。坚持细菌的百分比，然后可以坚持细菌的CFU数量除以除了坚持和非坚持的细菌菌落数计算。

为了说明检测的稳健性，我们可以比较与S4074进行了检测， 粘合剂猪胸膜肺炎放^线杆菌7致病株，与最近成立的气管仔猪细胞^株 ，NPTr 8细胞培养的这个协议。除了从媒体中的细菌和细胞生长所需的差异，唯一的区别是感染细菌的大幅增长是从文化，从一个固定相的过夜培养。 与 A 胸膜肺炎 ，它也是非常重要的，尊重MOI为10:1，并以不超过3个小时的感染，否则分泌的毒素会导致细胞死亡和偏见的结果。此外，这株A 的胸膜肺炎可以很容易地坚持以塑料的，因此重要的是使用融合细胞，并验证视觉细胞不塌。

本协议描述了一个标准的细菌黏附实验研究入侵（如使用庆大霉素保护^法 3）可以修改。菌落形成单位计数允许量化，如姬姆萨染色，在显微镜下，依靠标准的可视化技术的方法相比。后者只给出了一个定性的附着力，但往往是一个有益的补充，因为它可以区分各种图案的附着力和mechanistical ^见解 9 。例如，一个姬姆萨染色进行接种10 ⁷ cfu的2787，如图2所示，表明整个细胞表面上的弥漫性粘连，弥漫坚持 ^大肠杆菌 10的特点。

尽管此协议的定量方面，应该强调的是，结果通常是变量。有一个相当稳定的阳性和阴性对照之间的差异，与阴性对照通常有10 - 100倍较低水平的附着力比阳性对照。但是，从日常，粘连的比例可能有所不同2倍。因此，它往往是建议使用每两到三个重复实验，计划多次实验，并进行统计分析采用重复测量或配对测试（ANOVA或t检验）。

另一个关键的一点是清洗后的细菌粘附。必须小心不分离的上皮细胞。如果细胞脱落，然后会有不坚持细菌，以及。更多或更少的清洗，可用于清洗的数量（通常为2至4）坚持细菌的数量是非常相关，很大程度上取决于实验者就如何执行的清洗。应采用清洗的最低数量，允许低的背景。无论多少洗的选择，它是至关重要采用相同数量的所有水井的清洗和重复相同的手势，每洗一次执行的。

图2。姬姆萨染色，细菌从 E坚持以Hep - 2细胞的菌株2787 。