एक अवेध्य बालों नमूनाकरण मायावी छोटे स्तनधारी से उच्च गुणवत्ता डीएनए प्राप्त तकनीक

Henry, P., Henry, A., Russello, M. A. A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals. J. Vis. Exp. (49), e2791, doi:10.3791/2791 (2011).

अवेध्य आनुवंशिक नमूने दृष्टिकोण तेजी से महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं वन्यजीव आबादी का अध्ययन. अध्ययन का एक नंबर noninvasive नमूने तकनीक का उपयोग करने के लिए जनसंख्या आनुवंशिकी और जंगली ¹ आबादी की जनसांख्यिकी की जांच की सूचना है. यह दृष्टिकोण विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब दुर्लभ ^या मायावी 2 प्रजातियों के साथ काम कर साबित कर दी है. जबकि इन तरीकों की एक संख्या नमूना बाल, मल और मांसाहारी और मध्यम आकार के स्तनधारियों से अन्य जैविक सामग्री के लिए विकसित किया गया है, वे काफी हद तक मायावी छोटे स्तनधारियों में untested रहे हैं. इस वीडियो में, हम एक उपन्यास, सस्ता और noninvasive बाल एक मायावी छोटे स्तनपायी, अमेरिकी pika (Ochotona princeps) पर लक्षित जाल उपस्थित थे. हम बाल जाल है, जो पैकिंग टेप एक वेब की तरह फैशन में व्यवस्थित और pikas निवास स्थान में यात्रा मार्गों के साथ रखा के स्ट्रिप्स के होते हैं के सेट अप सामान्य वर्णन. हम बालों की एक बड़ी मात्रा में है कि और फिर एकत्र किया जा सकता है प्रयोगशाला में वापस लाया इकट्ठा जाल की दक्षता का वर्णन. हम तो डीएनए बुद्धि प्रणाली (Promega) का उपयोग करने के लिए डीएनए को अलग करने और यह सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले परमाणु microsatellites, प्रवर्धित टुकड़ा लंबाई बहुरूपताओं (AFLPs), mitochondrial दृश्यों (800bp) के रूप में के रूप में अच्छी तरह सहित आणविक मार्कर बढ़ाना विधि के उपयोगिता प्रदर्शन का प्रदर्शन आणविक sexing मार्कर. कुल मिलाकर, हम इस उपन्यास वन्यजीव आबादी जीव के लिए एक नमूना तकनीक के रूप में noninvasive बाल जाल की उपयोगिता प्रदर्शित करता है. हम आशा करते है कि इस दृष्टिकोण के छोटे स्तनधारियों की एक किस्म के लिए लागू हो सकता है, प्राकृतिक आबादी के भीतर जांच के क्षेत्रों को खोलने, जबकि अध्ययन के जीवों के लिए प्रभाव को न्यूनतम.

1. बालों का जाल

पहले एक जाल की स्थापना के लिए एक आदर्श स्थान pika वास या ढलान ढलान के भीतर निर्धारित किया है. इस घास का ढेर है, जो वनस्पति caches है कि जानवरों में देर के रूप में अच्छी तरह के रूप में गर्मियों में ताजा शौचालय साइटों पर पाया scats में जमा कर रहे हैं शामिल हैं. पैकिंग टेप (लंबाई में 10-50cm) के स्ट्रिप्स लुढ़का कर रहे हैं एक 360 ° चिपचिपा सतह प्रदान करने और एक वेब की तरह pika घास (छवि 1) ढेर या शौचालय साइट के द्वार लिफाफा तरीके में व्यवस्थित कर रहे हैं. चट्टानों के विन्यास पर निर्भर करता है, मछली पकड़ने की रेखा का एक टुकड़ा बाल जाल की संरचना का समर्थन करने में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस बार है जब प्रवेश द्वार काफी छोटे (<व्यास में 30cm), के उपयोग के पूर्ण विवरण नहीं आवश्यक मछली पकड़ने की रेखा हेनरी और Russello (2010) ³ में पाया जा सकता है . बालों snares के रूप में अक्सर संभव के रूप में जाँच कर रहे हैं, और बालों के नमूने टेप (छवि 2) पर जमा तो एकत्र कर रहे हैं और लेबल. एक बार प्रयोगशाला में वापस जाया जाता है, बाल चिपचिपा टेप का उपयोग कर बाँझ संदंश से हटा रहे हैं और क्रायोजेनिक ट्यूबों में स्थानांतरित और जब तक आगे हेरफेर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. बाल बाल जाल के साथ एक साथ clustered नमूने के एक व्यक्ति से संबंधित माना जाता है, जबकि स्वतंत्र क्लस्टर नमूने के विभिन्न व्यक्तियों से संबंधित ग्रहण कर रहे हैं. उत्तरार्द्ध मामले में, बाल तो विभिन्न ट्यूब में रखा गया है. इन मान्यताओं के बाद माइक्रोसेटेलाइट genotypic डेटा पर आधारित डीएनए उंगलियों के निशान और पहचान की संभावना की गणना के रास्ते से परीक्षण किया जा सकता है.

2. डीएनए निष्कर्षण

चूंकि pika बाल बहुत पतली है और एक छोटे रूट बल्ब होता है, हम पहले से पता चला है कि कम से कम 25 बाल की एक अच्छी गुणवत्ता ^{अनुप्रवाह} पीसीआर प्रवर्धन 3 ​​के लिए डीएनए के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. हम डीएनए बुद्धि प्रणाली (Promega, मैडिसन, WI, संयुक्त राज्य अमरीका) और बालों के नमूनों से डीएनए अलगाव के लिए निर्माता के निर्देशों के एक थोड़ा संशोधित संस्करण का इस्तेमाल किया. सबसे पहले, बाल नमूना नीचे एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र में घूमती है क्रम में करने के लिए बालों के नुकसान से बचने, जबकि ट्यूब खोलने. फिर ऊष्मायन समाधान डीटीटी 10μl (1M) और proteinase कश्मीर (18ng/ml) की 10μl के साथ ऊष्मायन समाधान के 80 μl 0.1 एम डीटीटी और proteinase लालकृष्ण ऊष्मायन के 1.8ng/ml के अंतिम एकाग्रता में परिणाम मिश्रण द्वारा तैयार है समाधान (100 μl) नमूना में जोड़ा जाता है और 56 में incubated डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के लिए. इस बीच, lysis समाधान जोड़ने lysis बफ़र के हर 100 μl डीटीटी 1M () की एक μl 0.01M की एक अंतिम डीटीटी एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा तैयार की है. तब नमूना तैयार lysis समाधान (200 μl) जोड़ा जाता है, डीएनए बुद्धि राल के 7 μl के साथ, उच्च गति पर 3 सेकंड के लिए vortexed और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated. नमूना तो 2 सेकंड के लिए vortexed है और चुंबकीय खड़ा है, जहां चुंबकीय मोतियों के समाधान से अलग होता है में सम्मिलित होती है. शेष समाधान और फिर से aspirated है त्याग, चुंबकीय राल की गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है. नमूना तो तैयार lysis समाधान, vortexed और चुंबकीय स्टैंड जहां जुदाई फिर होता है को लौट के 100 μl के साथ व्यवहार किया जाता है. lysis बफर और aspirated खारिज कर दिया, और इस कदम को तीन बार दोहराया है एक धोने बफर (100 μl) का उपयोग. नमूना बाद में 15 मिनट के लिए चुंबकीय स्टैंड में सूखी छोड़ दिया है. एक बार सूखा, elution बफर के 100 μl नमूना जोड़ा जाता है और 65 में incubated डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए. नमूना vortexed और चुंबकीय स्टैंड में सम्मिलित है. अब eluted डीएनए युक्त समाधान तो एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब को सौंप दिया है और जब तक आगे जोड़तोड़ -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत. जिगर नमूनों से डीएनए डीएनए बुद्धि प्रणाली का उपयोग कर निकाला गया था और पीसीआर amplifications के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया.

3. पीसीआर प्रवर्धन

हमारे noninvasive बाल जाल और जिगर के नमूनों से प्राप्त डीएनए तो आमतौर पर इस्तेमाल किया आणविक मार्कर (माइक्रोसेटेलाइट, AFLP, mitochondrial साइटोक्रोम बी और ZFX / ZFY sexing मार्कर) की एक सूट बढ़ाना इस्तेमाल किया गया. 20 एनजी डीएनए प्रत्येक प्राइमर का 0.5 सुक्ष्ममापी, 10 Tris - एचसीएल (8.3 पीएच), मिमी 50 मिमी 10: PCRs एक 25 μL मात्रा में Veriti थर्मल cycler (एप्लाइड Biosystems, फोस्टर शहर, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका) युक्त का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया KCl, 1.5 मिमी ₂ MgCl, 200 सुक्ष्ममापी dNTPs, 10 μ गोजातीय सीरम albumin (BSA, न्यू इंग्लैंड Biolabs, इप्सविच, MA, संयुक्त राज्य अमरीका) और 0.5 यू AmpliTaq गोल्ड डीएनए पोलीमरेज़ (एप्लाइड Biosystems). माइक्रोसेटेलाइट loci के लिए साइकल चलाना पैरामीटर एक touchdown साइकिल चालन प्रोग्राम (95 पर 10 मिनट का उपयोग कर अनुकूलित किया गया डिग्री सेल्सियस, 95 ° 30 एस सी, 30 एस annealing के 35 चक्र, और 72 पर 45 एस डिग्री सेल्सियस, 72 पर एक अंतिम कदम के द्वारा पीछा किया डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट के लिए). annealing तापमान 1 से कमी आई ° C 60 से 55 चक्र प्रति डिग्री सेल्सियस ° छठे चक्र, जो बिंदु पर 29 शेष चक्र 55 में जारी सी. तक पहुँचने जब तक Mitochondrial टुकड़े के लिए साइकल चलाना पैरामीटर के रूप में ऊपर वर्णित किया गया, लेकिन 35 चक्र का एक annealing के साथ शामिल50 डिग्री सेल्सियस का तापमान प्रवर्धित टुकड़ा लंबाई बहुरूपता ⁴ Bonin द्वारा वर्णित हड्डीवाला जीनोम के लिए प्रोटोकॉल के बाद किया गया था. अन्त में, आणविक sexing HinfI प्रतिबंध एंजाइम पाचन के साथ ⁵ ZFX / ZFY loci पीसीआर - RFLP का उपयोग किया गया था . माइक्रोसेटेलाइट AFLPs, और साइटोक्रोम बी दृश्यों से पीसीआर उत्पादों अबी 3130XL आनुवंशिक विश्लेषक (एप्लाइड Biosystems) पर चलाए जा रहे थे, जबकि पचा / ZFX ZFX टुकड़े एक 3% agarose जेल पर एक 100 बीपी सीढ़ी (न्यू इंग्लैंड Biolabs) युक्त के साथ - साथ चलाए जा रहे थे 2.5% SYBR सुरक्षित डीएनए जेल (Invitrogen, Carlsbad, CA, संयुक्त राज्य अमरीका) दाग और एक लाल व्यक्तिगत जेल इमेजिंग प्रणाली (अल्फा Innotech, San Leandro, CA, संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग करते हुए कल्पना. माइक्रोसेटेलाइट और AFLPs कल्पना Genemapper v3.7 (एप्लाइड Biosystems) और mitochondrial डीएनए chromatogram का उपयोग Sequencher v4.7 (जीन कोड निगम, एन हार्बर, एमआई, संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग करते हुए कल्पना था थे.

4. प्रतिनिधि परिणाम

बाल हमारे noninvasive जाल का उपयोग करने के लिए प्राप्त नमूने से निकाले डीएनए पीसीआर आणविक मार्करों के विभिन्न प्रकार बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया. तुलना के लिए एक आधार के रूप में डीएनए का उपयोग जिगर नमूने हमारे बालों के नमूने के साथ - साथ परिलक्षित किया गया था निकाली गई. परमाणु माइक्रोसेटेलाइट loci सफलतापूर्वक दोनों बाल और जिगर के नमूने (3 छवि) के लिए प्रवर्धित थे. हालांकि संकेत की तीव्रता अधिक था जब जिगर के नमूनों का प्रयोग, इस जीनोटाइप स्कोरिंग (3 छवि) पर एक प्रतिकूल प्रभाव नहीं था. इसी तरह के परिणाम (4 छवि) AFLPs, mitochondrial डीएनए अनुक्रम (छवि 5), और / ZFX ZFY आणविक sexing मार्कर (छवि 6) का उपयोग कर प्राप्त किया गया.

चित्रा 1 एक घास का ढेर में एक noninvasive बाल जाल का एक उदाहरण स्थापित किया . तक लुढ़का स्पष्ट पैकिंग टेप की स्ट्रिप्स घास का ढेर करने के लिए प्रवेश द्वार बंद करने के लिए एक वेब की तरह फैशन में व्यवस्थित होते हैं. मछली पकड़ने की रेखा का एक टुकड़ा यहां इस्तेमाल किया है बाल जाल के लिए अतिरिक्त सहायता प्रदान करने के लिए.

चित्रा 2 एक सफल बाल जाल पैकिंग टेप करने के लिए अटक बाल की एक बड़ी संख्या से युक्त.

चित्रा 3. एक प्रतिनिधि परमाणु माइक्रोसेटेलाइट (Ocp6) chromatogram ⁸ के रूप में v3.7 Genemapper (एप्लाइड Biosystems) में प्रदर्शित. शीर्ष chromatogram जिगर ऊतक से amplifying डीएनए द्वारा प्राप्त किया गया था, और इस बिन्दुपथ में विषमयुग्मजी (354/358). नीचे chromatogram एक अलग विषमयुग्मजी (358/362) जीनोटाइप बालों से निकाले डीएनए के आधार पर व्यक्तिगत प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करता है. जबकि बाल नमूना से chromatogram के संकेत जिगर नमूना की तुलना में एक कम तीव्रता है, जीनोटाइप स्कोरिंग प्रतिकूल संकेत में इस अंतर से प्रभावित नहीं है.

चित्रा 4 एक प्रतिनिधि AFLP (E31T32) chromatogram के रूप में v3.7 Genemapper (एप्लाइड Biosystems) में प्रदर्शित. शीर्ष chromatogram जिगर ऊतक से amplifying डीएनए द्वारा प्राप्त किया गया था, नीचे chromatogram बालों से निकाले डीएनए का प्रतिनिधित्व करता है.

5 चित्रा एक प्रतिनिधि mitochondrial डीएनए अनुक्रम (साइटोक्रोम बी) chromatogram Sequencher v4.7 (जीन कोड निगम) के रूप में प्रदर्शित. शीर्ष chromatogram जिगर ऊतक से amplifying डीएनए द्वारा प्राप्त किया गया था, नीचे chromatogram बालों से निकाले डीएनए का प्रतिनिधित्व करता है.

6 चित्रा एक प्रतिनिधि आणविक sexing मार्कर दोनों जिगर और बालों के नमूने के लिए (/ ZFX ZFY) प्रवर्धित. इस दृष्टिकोण अवलोकन है कि वाई गुणसूत्र के पास इस क्षेत्र में एक HinfI प्रतिबंध साइट है कि एक्स गुणसूत्र का अभाव है पर निर्भर करता है. इस प्रकार, महिलाओं 432 बीपी के दो सह पलायन टुकड़े जबकि पुरुषों के 432 बीपी, 261 बीपी और 171 बीपी के टुकड़े का उत्पादन.

अवेध्य आनुवंशिक नमूने कई कारणों के लिए पारंपरिक रहते फँसाने तरीकों के लिए एक आकर्षक विकल्प बन गया है. सबसे पहले, unobtrusively जंगली आबादी से जैविक सामग्री (जैसे, मल, बाल, पंख, लार और बलगम) को इकट्ठा करके, शोधकर्ताओं को परेशान बिना इन प्रजातियों का अध्ययन, हैंडलिंग, या यहां तक ​​कि उन्हें देख सकते हैं, इस प्रकार दोनों जानवरों और शोधकर्ताओं के लिए जोखिम को कम करने. दूसरा, noninvasive आनुवंशिक नमूने जीव मायावी और दुर्लभ प्रजातियों की आबादी, एक काम है कि अधिक परंपरागत रहते फँसाने ⁶ दृष्टिकोण के साथ मुश्किल साबित कर सकते हैं का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है. और तीसरे, NGS संभावित जानवर, नमूने के प्रयासों, और लागत को अशांति को कम करने से नमूना आकार बढ़ा सकते हैं, इस तरह ^{आबादी} 7 मापदंडों के अनुमान में biases के कम से कम मदद . यह बाद बात महत्वपूर्ण साबित जब संकटग्रस्त प्रजाति के साथ काम कर सकता है, के बाद से जनसंख्या मापदंडों का पक्षपाती अनुमान अनुचित प्रबंधन में परिणाम कर सकते हैं.

वर्तमान वीडियो लेख में हम एक सरल, उपन्यास, सस्ता और noninvasive मायावी छोटे स्तनपायी नमूना विधि का वर्णन है, एक उदाहरण के रूप में अमेरिकी Pika का उपयोग. हमें दिखाना है कि बालों से निकाले डीएनए माइक्रोसेटेलाइट, AFLP, mitochondrial और sexing मार्करों के लिए सम्मान के साथ जिगर नमूनों से निकाले डीएनए के लिए इसी तरह करता है, इस noninvasive नमूने विधि फँसाने या घातक नमूने जीने के लिए एक आकर्षक विकल्प बना. कुल मिलाकर, हम आशा करते हैं कि दुर्लभ या मायावी छोटे स्तनपायी प्रजातियों की आबादी आनुवंशिक और व्यवहार के अध्ययन के डेटा संग्रह चरण में इस पद्धति उपयोगी हो सकता है, जबकि अध्ययन के तहत जीवों पर प्रभाव को न्यूनतम.

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

हम क्षेत्र में सहायता के लिए एल इवांस, बी Granger, डी. Rissling, जेड सिम, ए. गुडविन, लालकृष्ण Hayhurst और डी. कुछ धन्यवाद देना चाहूंगा. लालकृष्ण Galbreath कृपया बेला Coola घाटी से pika जिगर नमूनों प्रदान किया. दिलचस्प चर्चा है कि इस noninvasive आनुवंशिक नमूने विधि के डिजाइन करने के लिए योगदान के लिए ए Goncalves डा सिल्वा और लालकृष्ण लार्सन के लिए धन्यवाद. इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल डिस्कवरी, और UBC Okanagan व्यक्तिगत मार्च के लिए अनुसंधान अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. एक स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन डॉक्टरेट PBSKP3_128523 फैलोशिप समर्थित पीएच. यह अध्ययन ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय (: A07-0126 प्रमाणपत्र संख्या) से जानवरों की देखभाल प्रोटोकॉल के बाद किया गया था.

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