一个实时的基于电阻抗技术测量癌细胞入侵内皮细胞单层

Rahim, S., Üren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792, doi:10.3791/2792 (2011).

恶性细胞的转移传播需要通过降解基底膜的肿瘤细胞附着到血管内皮，内皮路口回缩和最后的入侵和肿瘤细胞迁移的内皮细胞层，进入血液中作为一种交通工具在主机的遥远的地方^1-3。一旦在循环系统，癌细胞坚持毛细血管壁渗出到周围组织，形成转移性肿瘤^4,5。在体外肿瘤细胞 - 内皮细胞相互作用的各个组成部分，是可以复制的，通过挑战的人脐静脉内皮细胞与肿瘤细胞（HUVEC）的单层。电子和相衬显微镜进行的研究表明，事件的顺序，在体外， 公平地代表在体内^的转移过程6。在这里，我们描述了一个基于电阻抗技术，监控和实时的内皮细胞恶性肿瘤细胞的侵袭量化。

Giaever和Keese首先描述了在阻抗测量波动的技术，当一个细胞的人口^在电极表面7,8增长。 xCELLigence仪器，由罗氏公司生产的，采用类似的技术来测量电阻抗的变化，细胞附着，并与金微电极阵列，井底，涵盖了约80％的面积覆盖了培养皿中蔓延。随着细胞的附着和传播在电极表面时，它会^导致增加9-12电阻抗。阻抗显示为一个被称为细胞的无量纲参数指标，这是成正比的组织文化是由细胞所涵盖的总面积。因此，细胞指数可用于监测细胞粘附，铺展，形态和细胞密度。

本文中所描述的入侵检测是基于电阻抗的变化，在电极/细胞间，作为一个人口恶性细胞通过脐静脉内皮细胞单层（图1）侵入。内皮路口中断，导致肿瘤细胞的内皮细胞单层和更换回缩阻抗大的变化。这些变化直接相关，与肿瘤细胞的浸润能力，高度侵略性的细胞入侵导致细胞阻抗大的变化，反之亦然。这种技术提供了两方面的优势超过现有的测量入侵方法，如Boyden小室和基质胶实验，：1）内皮细胞肿瘤细胞的互动更加紧密地模仿体内过程，和2）的数据是实时获得时间和更容易量化，而不是终点分析等方法。

1。制备

1. 应在组织培养罩无菌条件下进行的所有步骤。
2. xCELLigence站被放置在37℃培养箱中培养，在5％的_CO 2的存在。
3. 使用低传脐静脉内皮细胞细胞，最好不超过6通过。此外，请确保这些细胞是在收获时间不超过75％汇合。
4. 重组与脐静脉内皮细胞生长在EGM - 2媒体EGM - 2含有生长因子，补充和5％胎牛血清的子弹试剂盒（龙沙生物科学）。
5. 细胞悬浮液中的胰蛋白酶的所有痕迹，应该从纺在200xg细胞，用PBS洗涤一次，他们表示细胞密度和resuspending。
6. 大衣xCELLigence 0.1％明胶1小时电子盘16在37 ° C或隔夜在4 ° C用PBS清洗板和添加100μL重组EGM - 2媒体。执行xCELLigence系统的空白读数，测量细胞的缺失的背景阻抗。

2。生成人脐静脉内皮细胞单层

1. 收获HUVEC细胞经胰蛋白酶分合流烧瓶。悬浮细胞在重组的EGM - 2媒体的最终密度2.5 × ¹⁰ 5细胞/ ml 。
2. 每个井的背景下校准电子盘含有100μLEGM - 2媒体，添加的血管内皮细胞的细胞悬液（2.5 × ¹⁰ 4 HUVEC细胞）100μL 。
3. xCELLigence仪器立即安装电子盘。
4. 计划xCELLigence软件在10分钟的时间间隔执行的阻抗读数。
5. 让血管内皮细胞生长为18-21小时，直到它们形成一个单层，扁平化的细胞指数（图2）证明。

3。侵入细胞的增加和数据规范化。

1. 一旦已经形成一个稳定的人脐静脉内皮细胞单层，收获肿瘤胰蛋白酶和悬浮细胞的最终密度1 × ¹⁰ 5细胞/毫升用于种植的肿瘤细胞（如媒体的RPMI或DMEM培养基含10％FBS）的媒体
2. 暂停xCELLigence软件阻抗读数和删除从站的电子盘。
3. 卸下吸EGM - 2介质。新增的肿瘤细胞含有1 × 10 ⁴细胞的悬浮液100μL 。一般来说，1:2.5比例的肿瘤细胞：内皮细胞的种子，最好的检测。然而，这个比例可以优化个别的细胞株。
4. xCELLigence系统的E -板放置在孵化器，并继续以10分钟为间隔的阻抗读数。
5. 由于回缩内皮路口和渗透入侵肿瘤细胞在细胞指数的下降在未来的6-12小时的入侵，可实时监测。
6. 正常化的结果除了入侵肿瘤细胞的时间。 xCELLigence软件许可正常化的任何时间点，并可以直接在软件窗口中查看结果。

4。代表性的成果：

转移性和非转移性细胞人脐静脉内皮细胞单层入侵的例子是如图3所示。 K7M2是一个转移的骨肉瘤细胞株。这些细胞表达高水平的骨架连接器蛋白ezrin， ^占 13,14此细胞株的侵入。当脐静脉内皮细胞细胞与K7M2细胞的挑战，是在6小时内电阻下降。这种电阻下降的血管内皮细胞单层的入侵肿瘤细胞的侵袭。另一方面，K12的细胞系，表达ezrin的水平要低得多，因此较少^转移 13 。挑战与K12的细胞在电阻值急剧下降的结果血管内皮细胞单层的细胞无法通过脐静脉内皮细胞单层（图 3）坚持或入侵。

图1。肿瘤细胞的血管内皮细胞的侵袭，工作流过程的示意图。 HUVEC细胞接种于明胶涂层电子牌照，并允许形成一个融合的单层。恶性细胞的形成和实时监控入侵细胞指数的变化，由于入侵的内皮细胞单层单层添加一次。

图2。人脐静脉内皮细胞单层形成 。在细胞指数的变化HUVEC细胞明胶包金电极上的附着并传播。形成一个融合的单层为代表的18小时后的细胞指数稳定。

图3。 K7M2和K12骨肉瘤细胞HUVEC细胞的入侵。一个在CEL急剧下降L -指数引进高转移K7M2细胞在几个小时内发生。 K12的细胞，另一方面，转移较少，无法有效K7M2细胞渗透到血管内皮单层。这是代表由当人脐静脉内皮细胞单层挑战与K12的细胞在细胞指数急剧下降。控制癌细胞的情况下在血管内皮细胞单层的阻抗。实验是在一式三份。

实时的人脐静脉内皮细胞的入侵检测是一种简单，但功能强大的入侵监测的方法。它提供实时，这是一个显着的优势比其他传统技术依赖终点分析的结果。该试剂盒可以进行修改，以测试药物，抗体，配体和蛋白质转移酶抑制剂或刺激。可以评估以及不同药物对内皮细胞/肿瘤细胞串扰的影响。在引进外因，如在培养基生长因子和药物，重要的是，以确保它们不会影响人脐静脉内皮细胞单层的完整性。人脐静脉内皮细胞单层的中断可以进行测试，在侵入细胞的情况下，通过引入外源性代理，并确保有细胞指数没有变化。因此，适当的控制应包括实验设计的一部分。

不同细胞系表现出不同的细胞指数曲线，因为它们形成了一个融合的单层。曲线的形状，以及最大的细胞指数达到，是细胞类型的具体。 HUVEC细胞显示细胞指数不上不下的播种后4-6小时，其次是稳定在16-18小时后的细胞指数较高的另一个特征瞬态。因此，重要的是让这些细胞形成了至少18小时之前，除了肿瘤细胞融合单层。

由于细胞指数是依赖于离子在电极/细胞间环境中各种因素的影响，如细胞形态和细胞 - 细胞粘连的质量细胞指数，以及覆盖底部面积。因此，肿瘤细胞的侵袭后，发生在细胞指数的下降，这是一个功能的几个因素，其中包括回缩内皮路口和后续的肿瘤细胞的侵袭。

xCELLigence仪器制造三种不同的配置：实时细胞分析仪（RTCA）SP，RTCA MP和RTCA DP。 RTCA SP的仪器拥有96电子盘而RTCA MP仪器可以同时容纳多达6 96电子板。这使得药物和化合物的高通量筛选。在这篇文章中的实验使用的RTCA DP仪器，可容纳16电子板。每个E -板控股站可独立运作的，它允许多个用户同时运行实验。 RTCA DP仪器也可用于研究使用CIM板的迁移。这些都是聚乙烯terephtalate（PET）与中位数的8um孔径的膜分离上下商会的16孔板。电子传感器位于上议院的多孔膜的底面。下室作为一个在上腔细胞趋化水库。然而，在CIM -板的血管内皮细胞的入侵检测的主要优点是肿瘤细胞的侵袭，前者是没有限制的孔径，内皮细胞的侵袭取决于肿瘤和内皮细胞之间的串扰。

ECIS ž仪器还可以进行人脐静脉内皮细胞的侵袭实验，应用生物物理学（特洛伊，纽约州）生产。企业家信心指数ž仪器xCELLigence仪器采用了类似的技术，阵列和电极配置的差异。我们已经成功地进行了血管内皮细胞的入侵检测，使用8 ECIS阵列。重要的是要注意，底部表面面积较大的企业家信心指数的阵列，这就需要较大的内皮细胞和肿瘤细胞的数量要镀：2.5 ^{× 10 5和} 1 × 10 5细胞分别。

这个手稿的出版成本，请罗氏应用科学部提供。

慷慨支持这项工作是由儿童癌症基金会（巴尔的摩，MD），布兰登 - 卡林顿李氏基金会（银泉，MD），国防部（W81XWH - 10 - 1 - 0137）和美国国立卫生研究院（R01CA108641）的资金。

我们要感谢安东Wellstein博士和他的实验室成员分享他们的经验和帮助我们优化提出的方法。

1. Klein, C.A. Cancer. The metastasis cascade. Science 321, 1785-1787 (2008).
2. Chiang, A.C.& Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med 359, 2814-2823 (2008).
3. Orr, F.W., Wang, H.H., Lafrenie, R.M., Scherbarth, S. & Nance, D.M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol 190, 310-329 (2000).
4. Bacac, M. & Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol 3, 221-247 (2008).
5. Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature 441, 444-450 (2006).
6. Kramer, R.H. & Nicolson, G.L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A 76, 5704-5708 (1979).
7. Giaever, I. & Keese, C.R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 3761-3764 (1984).
8. Giaever, I. & Keese, C.R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 7896-7900 (1991).
9. Tiruppathi, C., Malik, A.B., Del Vecchio, P.J., Keese, C.R. & Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 7919-7923 (1992).
10. Whipple, R.A., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res 70, 8127-8137 (2010).
11. Boyd, J.M., et al. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta 615, 80-87 (2008).
12. Khanna, C., et al. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med 10, 182-186 (2004).
13. Ren, L., et al. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene 28, 792-802 (2009).

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