Kanser Hücreleri Endotel Hücre Monolayer Invasion Tedbir Gerçek zamanlı Elektrik Empedans Tabanlı Tekniği

Rahim, S., Üren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792, doi:10.3791/2792 (2011).

Metastatik malign hücrelerin yayılması, konak uzak bölgelere ulaşım aracı olarak kan dolaşımına girmek için endotel tabakası ile bazal membran, tümör hücreleri vasküler endotel ek, endotel kavşak çekilmesi ve nihayet işgali ve tümör hücrelerinin göç bozulması gerektirir ^1-3. Dolaşım sistemi, kanser hücrelerinin duvarları kapiller ve metastatik tümörler ^4,5 oluşturmak üzere çevresindeki doku extravasate yapışır. Tümör hücre-endotelyal hücre etkileşimi çeşitli bileşenleri, kanser hücreleri insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) bir tek tabaka zorlu in vitro olarak çoğaltılmış olabilir. Elektron ve faz-kontrast mikroskobu ile yapılan çalışmalar, in vitro olaylar dizisi içinde oldukça in vivo metastatik ^süreci 6 temsil ettiğini düşündürmektedir . Burada, endotel hücreleri malign tümör hücreleri tarafından gerçek zamanlı işgali izler ve rakamlarla bir elektrik empedans tabanlı teknik açıklar.

Hücrelerden oluşan bir nüfus elektrot yüzeyinde ^7,8 büyüyecek Giaever ve Keese ilk empedans dalgalanmaların ölçüm için kullanılan bir tekniktir. Roche tarafından üretilen xCELLigence enstrüman, hücreleri bir kuyunun altındaki alanın yaklaşık% 80 kapsayan bir altın mikroelektrot dizisi ile kaplı bir kültür çanak takın ve yayılması gibi empedans değişiklikleri ölçmek için benzer bir teknik kullanır. Hücreleri elektrot yüzeyine tutunur ve yayıldıkça, ^9-12 empedans artışa yol açar. Empedans hücreleri ile kaplıdır doku kültürü toplam alanı ile doğru orantılıdır boyutsuz bir parametre olarak adlandırılan hücre indeksi, olarak görüntülenir. Bu nedenle, hücre indeksi hücre yapışma, yayılma, morfolojisi ve hücre yoğunluğu izlemek için kullanılabilir.

Malign hücrelerin bir nüfus HUVEC tek tabaka (Şekil 1) ile işgal elektrot / hücre interfaz empedans değişiklikler, bu makalede anlatılan işgali tahlil dayanmaktadır. Endotel kavşaklarından bozulması, tümör hücreleri tarafından endotel tek tabaka ve yedek retraksiyon empedans büyük değişikliklere yol açar. Bu değişiklikler tümör hücrelerinin invaziv kapasitesi ile doğrudan ilişkilidir, yani, son derece agresif hücreleri tarafından işgali, hücre empedansı ve tersi büyük değişikliklere yol. Endotel hücre tümör hücre etkileşimi daha yakından in vivo sürecinde taklit eder, ve 2) gerçek veri elde edilir) 1: Bu teknik, mevcut işgali ölçüm yöntemleri üzerinde Boyden çemberinin ve matrigel deneyleri olarak iki kat avantaj sağlar zaman ve diğer yöntemler için, daha kolay ölçülebilir, uç nokta analizi karşı.

1. Hazırlık

1. Tüm adımlar, bir doku kültürü kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır.
2. % 5 CO ₂ varlığında, 37 ° C inkübatör xCELLigence istasyonu yerleştirilir .
3. Tercihen geçişi 6 daha fazla, düşük geçit HUVEC hücreleri kullanın. Ayrıca, hücreler hasat sırasında% 75 daha fazla konfluent olduğundan emin olun.
4. HUVEC hücreleri ile sulandırılır EGM-2 medya yetiştirilen EGM-2 mermi kiti (Lonza Biosciences), büyüme faktörleri, ek ve% 5 fetal sığır serumu içeren.
5. Tripsin tüm izleri, 200xg hücreleri iplik, bir kez PBS ile yıkama ve belirtilen hücre yoğunlukları resuspending hücre süspansiyonları çıkarılmalıdır.
6. Kat xCELLigence E-plaka 16 37 jelatin 1 saat süreyle% 0.1 ile 4 ° C veya bir gecede ° C. Plaka PBS ile yıkayın ve 100μL sulandırılmış EGM-2 medya ekleyin. XCELLigence sistemi hücrelerinin yokluğunda arka plan empedansını ölçmek için boş bir okuma gerçekleştirin.

2. Yaratma HUVEC tek tabakalı

1. Trypsinization tarafından HUVEC hücrelerinin bir alt-konfluent balon Hasat. 2.5 x 10 ⁵ hücre / ml nihai yoğunluğu sulandırılmış EGM-2 medya hücrelerinin yeniden süspanse edin.
2. Her bir kuyu için bir arka plan 100μL EGM-2 medya içeren e-plaka HUVEC hücre süspansiyonu (2.5 x 10 ⁴ HUVEC hücreleri) 100μL eklemek kalibre.
3. E-Plate xCELLigence aracı hemen yükleyin.
4. Program 10 dakikalık aralıklarla empedans okuma gerçekleştirmek için xCELLigence yazılım.
5. Bir düzleşme hücre indeksi (Şekil 2) ile kanıtlandığı gibi, bir tek tabaka oluşana kadar, endotel hücreleri 18-21 saat büyümek .

3. Istilacı hücreleri ve veri normalleştirme eklenmesi.

1. Bir istikrarlı HUVEC tek tabaka, tümör hücrelerinin (RPMI veya DMEM medya olarak% 10 FBS içeren) büyümeye kullanılan medya 1 x ¹⁰ 5 hücre / ml son bir yoğunluğu trypsinization ve tekrar süspansiyon hasat tümör hücreleri oluşmuştur
2. Pause empedansı xCELLigence yazılım okumalar ve istasyon E-Plaka çıkarın.
3. Aspirasyon EGM-2 medya çıkarın. 1 x 10 ^{4 hücreli} tümör hücresi içeren süspansiyon 100μL ekleyin. Genel olarak, tümör hücrelerinin 1:2.5 oranı: endotel hücreleri numaralı seribaşı, tahlil için en iyi çalışır . Ancak, bu oran her bir hücre hatları için optimize edilebilir.
4. Inkübatör xCELLigence sistemi E-plaka koyun ve 10 dakika aralıklarla empedans okumaları devam ediyor.
5. Invasion tümör hücreleri işgal ederek endotel kavşaklar ve penetrasyon çekilmesi nedeniyle hücre indeksi bir düşüş olarak sonraki 6-12 saat üzerinden gerçek zamanlı olarak izlenebilir.
6. Tümör hücreleri istila ek süre Normale. XCELLigence yazılım, herhangi bir zaman noktasında normalleşme izin ve sonuçları doğrudan yazılım penceresinde görülebilir.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Metastatik ve metastatik olmayan hücreler tarafından HUVEC tek tabaka işgali bir örnek Şekil 3'te gösterilmiştir. K7M2 metastatik osteosarkom hücre hattı. Bu hücreler, bu hücre ^hattı 13,14 invaziv özellikleri için hangi hesapların, iskelet bağlayıcının protein Ezrin yüksek düzeyde ifade eder . HUVEC hücreler K7M2 hücreleri ile meydan, 6 saat içinde elektriksel direnci bir düşüş var. Elektriksel direnç Bu düşüş HUVEC tek tabaka işgalci tümör hücreleri tarafından işgali temsil eder. K12 hücre hattı, diğer taraftan, Ezrin çok düşük seviyelerde ifade ve dolayısıyla daha az metastatik ^13. Direnç daha az dik açılan K12 hücreleri sonuçları ile HUVEC tek tabaka hücreleri uymak veya HUVEC tek tabaka (Şekil 3) ile işgal etmek için mümkün olduğu zorlu.

Şekil 1. Endotel hücreleri tümör hücreleri tarafından işgali için iş akış sürecinin şematik diyagramı. HUVEC hücreleri jelatin kaplı E-plakalar üzerinde kaplama ve konfluent tek tabaka oluşturacak şekilde izin verilir. Malign hücrelerin tek tabaka oluşmuştur ve hücre indeksi, endotel monolayer işgali nedeniyle değişiklikleri gibi işgalinin gerçek zamanlı olarak izlenir sonra eklenir.

Şekil 2. HUVEC tek tabaka oluşumu. Hücre indeksi HUVEC hücrelere tutunur ve jelatin kaplı altın elektrotlar üzerinde yayılmış olarak değiştirir. Konfluent tek tabaka oluşumu, 18 saat sonra hücre indeksi bir istikrar ile temsil edilmektedir.

Şekil 3. HUVEC hücrelerinin K7M2 ve K12 osteosarkom hücreler tarafından işgali. Cel bir dik düşüşl-indeksi yüksek metastatik K7M2 hücrelerinin giriş bir kaç saat içinde oluşur. K12 hücreleri, diğer taraftan daha az metastatik kadar verimli K7M2 endotel hücreleri gibi tek tabaka nüfuz edemiyoruz. Bu HUVEC tek tabaka K12 hücreleri meydan hücre indeksi daha dik bir azalma tarafından temsil edilmektedir. Kontrol kanser hücrelerinin yokluğunda HUVEC tek tabaka empedans temsil eder. Deneyler, üç nüsha olarak yapılmıştır.

HUVEC işgali tahlil gerçek zamanlı izleme işgali için basit ama güçlü bir yöntemdir. Bu son nokta analizi güveniyor diğer geleneksel teknikleri üzerinde önemli bir avantaj gerçek zamanlı, sonuçlar sağlar. Tahlil, test ilaçlar, antikorlar, ligandlar ve proteinlerin inhibitörleri veya metastaz uyarıcıları olarak değiştirilebilir. Endotel / kanser hücresi cross-talk farklı ajanların etkisi de tespit edilebilir. Gibi büyüme faktörleri, kültür ortamı ve uyuşturucu gibi eksojen ajanlar tanıtılması, HUVEC tek tabaka bütünlüğünü etkilemez sağlamak için önemlidir. HUVEC tek tabaka bozulması istilacı hücrelerin yokluğunda eksojen ajan tanıtmak ve hücre indeksi hiçbir değişiklik olmadığını sağlanması test edilebilir. Böylece, uygun kontroller deney tasarımının bir parçası olarak dahil edilmelidir.

Konfluent tek tabakalı biçimi olarak farklı hücre hatları farklı hücre indeksi eğrileri göstermektedir. Eğrinin şekli yanı sıra elde hücre indeksi, maksimum hücre türüne özgü. HUVEC hücreleri 16-18 saat sonra daha yüksek bir hücre dizindeki başka bir istikrar, ardından 4-6 saat sonra tohumlama hücre indeksi düzleştirme bir karakteristik geçici göstermektedir. Bu nedenle, hücrelerin tümör hücrelerinin yanı sıra en az 18 saat önce konfluent tek tabaka oluşturur izin vermek önemlidir.

Hücre indeksi elektrot / hücre interfaz iyonik çevreye bağımlı olduğundan, bu tür hücre morfolojisi ve hücre-hücre yapışıklıklar kalitesi gibi çeşitli faktörlere kaplı iyi alt bölgeye ek olarak, hücre indeksi etkilemektedir. Bu nedenle, endotel kavşaklar ve sonraki tümör hücresi invazyonu çekilmesi gibi çeşitli faktörler, tümör hücresi tarafından işgal edilmesinden sonra ortaya çıkan hücre endekste düşüş, bir fonksiyonudur.

Gerçek zamanlı hücre analizörü (RTCA) SP, RTCA MP ve Rtca DP: xCELLigence aracı üç farklı konfigürasyonlarda imal edilmektedir. RTCA SP enstrüman RTCA MP enstrüman, aynı anda 96-kuyu altı E-plakaları adete kadar ise 96-iyi bir E-plaka tutar. Bu, ilaç ve bileşikleri yüksek verimli tarama sağlar. Bu makalede deneyler, üç 16-iyi E-plakaları tutabilir RTCA DP enstrüman kullanılarak yapılmaktadır. Her E-plaka tutma istasyonu birden fazla kullanıcı aynı anda deneyler çalıştırmak için izin veren, bağımsız olarak çalıştırılabilir. RTCA DP araç aynı zamanda göç CIM plakaları kullanarak çalışma için kullanılabilir. Bunlar, 8um medyan gözenek boyutu ile polietilen tereftalat (PET) membran ile ayrılmış alt ve üst odaları ile 16 kuyucuğu. Elektronik sensörler gözenekli membran üst odasının alt tarafında yer almaktadır. Alt kamara üst kamara hücreleri için kemoatraktan için bir rezervuar olarak hizmet vermektedir. Ancak, CIM plakaları üzerinden HUVEC işgali testinin önemli bir avantaj, endotel hücre invazyonu tümör ve endotel hücreleri arasındaki çapraz tartışma bağlı olarak eski tümör hücresi invazyonu, gözenek boyutu ile sınırlı değildir olduğunu.

HUVEC işgali tahlil Uygulamalı Biyofizik (Troy, NY) tarafından üretilen, ECIS Z enstrüman yapılabilir. ECIS Z enstrüman, dizi ve elektrot konfigürasyonları farklılıklar ile xCELLigence enstrüman benzer bir teknoloji kullanır. Biz 8-iyi ECIS dizileri kullanarak HUVEC işgali testleri başarıyla gerçekleştirdik. Sırasıyla 2.5 x 10 ⁵ ve 1 x 10 ⁵ hücreleri de alt yüzey alanı kaplama olarak endotel ve tümör hücrelerinin daha büyük bir sayı gerektirir ECIS diziler, büyük olduğunu dikkate almak önemlidir.

Bu yazının yayınlanması maliyeti nazik Roche Uygulamalı Bilimler tarafından sağlanmıştır.

Bu çalışma cömertçe Çocuk Kanseri Vakfı (Baltimore, MD), Brandon Lee Carrington Vakfı (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) ve NIH (R01CA108641) fonları tarafından desteklenmiştir.

Biz, onların deneyim paylaşımı ve bize sunulan yöntemler optimize etmek için yardımcı olmak için onun laboratuvar Dr. Anton Wellstein ve üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

1. Klein, C.A. Cancer. The metastasis cascade. Science 321, 1785-1787 (2008).
2. Chiang, A.C.& Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med 359, 2814-2823 (2008).
3. Orr, F.W., Wang, H.H., Lafrenie, R.M., Scherbarth, S. & Nance, D.M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol 190, 310-329 (2000).
4. Bacac, M. & Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol 3, 221-247 (2008).
5. Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature 441, 444-450 (2006).
6. Kramer, R.H. & Nicolson, G.L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A 76, 5704-5708 (1979).
7. Giaever, I. & Keese, C.R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 3761-3764 (1984).
8. Giaever, I. & Keese, C.R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 7896-7900 (1991).
9. Tiruppathi, C., Malik, A.B., Del Vecchio, P.J., Keese, C.R. & Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 7919-7923 (1992).
10. Whipple, R.A., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res 70, 8127-8137 (2010).
11. Boyd, J.M., et al. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta 615, 80-87 (2008).
12. Khanna, C., et al. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med 10, 182-186 (2004).
13. Ren, L., et al. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene 28, 792-802 (2009).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.