הוצאת הקרביים של הזגוגיות עכבר רשתית עבור ניתוח proteomic

Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses. J. Vis. Exp. (50), e2795, doi:10.3791/2795 (2011).

בעוד הרשתית עכבר התפתחה כמודל גנטי חשוב למחלות רשתית תורשתיות, הזגוגית העכבר נשאר כדי להיחקר. זגוגי הוא תאי מטריקס מימית מאוד המכסה את הרשתית שבו התוך עיני, כמו גם חלבונים extraocular לצבור במהלך המחלה. אינטראקציות בין ^1-3 חריגות זגוגי ו הרשתית ביסוד מספר מחלות כגון ניתוק הרשתית, רטינופתיה סוכרתית שגשוג, uveitis, ו vitreoretinopathy שגשוג ^{1. , 4} נפח יחסית זגוגי העכבר הוא קטן יותר באופן משמעותי זגוגי האנושי (איור 1), כיוון את העדשה העכבר תופס כמעט 75% של העין שלה. ⁵ זה עשה מחקרים ביוכימיים של הזגוגית עכבר מאתגר. במאמר זה וידאו, אנו מציגים טכניקה לנתח ולבודד את העכבר מן הזגוגית הרשתית, אשר יאפשר שימוש במודלים עכבר מהונדס יותר להגדיר בבירור את תפקידו של מטריצה ​​זו תאיים בהתפתחות של מחלות vitreoretinal.

1. קטע Anterior לנתיחה.

1. רקמה Scleral האחורי של לימבוס נתפסת עם המלקחיים 0.22 ו הגלובוס (כדור העין) הוא התייצב.
2. להב microsurgical משמש לביצוע חתך ליניארי הקרנית מ לימבוס כדי לימבוס.
3. 0.12 קוליברי המלקחיים מכן נעשה שימוש כדי לתפוס את הקרנית על החתך.
4. נוזל תא קדמי נספג אז עם חנית Weck-cel כירורגי.

2. עדשה הוצאת הקרביים.

1. 0.12 קוליברי המלקחיים לתפוס את הקרנית משמש כדי לייצב את כדור הארץ.
2. בעל קנס מחט מעוקל (או מלקחיים ההלבשה מעוקל) מוכנס מאחורי העדשה כלפי הצד האחורי של כדור הארץ. בעל מחט סגור חלקית, ומשך קדימה. הלחץ מיושם באמצעות מלקחיים על פני השטח החיצוניים של בלובן העין, אשר דוחף קדימה את העדשה דרך חתך בקרנית תוך השארת קיר שלם העין. זגוגי נראה כמו ג'ל שקוף, והוא חסיד חלקית העדשה.
3. הרקמה עדשה זגוגי ממוקם אז לתוך צינור צנטריפוגה מסונן המכיל 20 מיקרוליטר של קוקטייל מעכב פרוטאז (Roche) מומס PBS.

3. רשתית הוצאת הקרביים.

1. המשך לייצב את העולם עם 0.12 מלקחיים קוליברי לתפוס את חתך בקרנית.
2. בעל קנס מחט מעוקל (או מלקחיים ההלבשה מעוקל) ממוקם כ האחורי בהרבה הגלובוס ככל האפשר, ליד עצב הראייה. בעל מחט סגור חלקית, ומשך קדימה. הלחץ מיושם באמצעות מלקחיים על פני השטח החיצוניים של בלובן העין, אשר דוחפת את הרשתית קדימה דרך חתך בקרנית. זגוגי נראה כמו ג'ל שקוף חסיד אל הרשתית. הרשתית היא דמיינו כמו רקמה צהוב vascularized,. כל רצועות של רקמות פיגמנט ניתן התקלף עם מלקחיים.
3. רקמת הרשתית-זגוגי ממוקם אז לתוך הצינור צנטריפוגות מסונן המכיל את רקמת עדשה זגוגי.

4. מסוננים צנטריפוגה.

1. צינור צנטריפוגות מסוננים ממוקם צנטריפוגה benchtop. ספין על 14,000 x G במשך 12 דקות.
2. לשאוב eluant מן החדר התחתון, המהווה את הזגוגית. הרשתית נשאר בחדר העליון. דגימות אלה יכול להיות מנוצל ללימודים חלבון.

5. נציג תוצאות

דגימות הזגוגיות נותחו על ידי SDS-PAGE (איור 2). דוגמאות ששימשו גם assay הפעילות האנזימטית (איור 3).

איור 1. דיאגרמה עכבר עין. חתך סכימטי של העין האנושית ועכבר מציג את נפח קטן יחסית הזגוגית בעין את העכבר בשל העדשה שלו גדול יותר.

איור 2. חד ממדית SDS-PAGE של הזגוגית העכבר הרשתית. חלבון פרופילים של הזגוגית העכבר, 13.6 מ"ג / מ"ל ​​(מסלול 1), רשתית, 11.35 מ"ג / מ"ל ​​(מסלול 2). ג'ל אלקטרופורזה בוצע ב kV 150 במשך 45 דקות, מוכתם פלמינגו פלורסנט כתם ג'ל דמיינו באמצעות מערכת דימות VersaDoc (BioRad, הרקולס, CA).

איור 3. Superoxide dismutase (SOD) האנזים פעילות העכבר זגוגי האדם. מדידה של פעילות SOD הכולל (פעילות SOD colorimetric aasay הערכה, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) בוצע על הזגוגית לבין הרשתית שנאספו על ידי הוצאת הקרביים מעכברים DBA ו לבקנים. זה היה לעומת פעילות הליבה SOD זגוגי האדם הרשתית האנושית שנאספו שלאחר המוות בעיניים התורם האנושי כדי לקבוע פעילות יחסי. חי דגימות ליבה זגוגי היו aspirated באופן ידני באמצעות מחט 23-מד, ¹¹ ו הרשתית נאסף על ידי פריחה העין חיתוך הרקמה מן הרשתית מורכבת / דמית העין. למרות assay אינו מבחין בין isoforms SOD, הפעילות SOD זגוגי עשוי לשקף SOD3, שכן הוא איזופורם רק תאיים ¹² הפעילות SOD הרשתית עשוי לשקף את כל isoforms SOD שלושה:. SOD1 תאיים, המיטוכונדריה SOD2 ו תאיים SOD3. האנזימטית ¹² עבור מבחני רגישות גבוהה, כולל assay זה SOD, את האפשרות של זיהום צולב של חלבונים אפשרי ודורש מחקר נוסף. ברים שגיאה מייצגים SEM.

העכברים הטרנסגניים מהווים מודל חשוב לחקר מחלת הרשתית vitreoretinal. ^6-10 הגוף הזגוגי העכבר, לעומת זאת, מהווה חלק קטן יותר באופן משמעותי של העין בהשוואה זגוגי האדם בשל העדשה גדול בעין העכבר. ⁵ זה עושה קשה לבודד ולטהר את הזגוגית העכבר. הבנת השינויים חלבון קשורה הזגוגית במהלך מחלות כגון רטינופתיה סוכרתית שגשוג, הקשורות לגיל ניוון מקולרי, uveitis, ועל ניתוק הרשתית ייתן תובנה המנגנונים שבאמצעותם הם התקדמות. זה פרוטוקול הניסוי דמיינו מספק אמצעי להשיג לטהר את הגוף הזגוגי העכבר, תוך מיקסום התשואה חלבון עבור ניתוחים האנזימטית proteomic.

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם האגודה למחקר חזון בהצהרה עיניים לשימוש של בעלי חיים עיניים ומחקר החזון.

המימון ניתן על ידי להילחם עבור Sight ומחקר כדי למנוע עיוורון.

1. Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344, doi:S1350-9462(99)00016-6 [pii] (2000).
2. Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. & Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J. Proteome Res. 7, 2516-2525, doi:10.1021/pr800112g (2008).
3. Izuta, H. et al. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).
4. Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).
5. Smith, R. S. in Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods eds R.S. Smith, S.W.M. John, P.M. Nishina, & J.P. Sundberg) 161-195 (CRC Press, 2002).
6. Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E. & Sandberg-Lall, M. Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene. Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).
7. Kaarniranta, K. et al. A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1). Exp. Eye Res. 83, 297-303, doi:10.1016/j.exer.2005.11.027 (2006).
8. Marneros, A. G. & Olsen, B. R. Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).
9. Martin, A. C. et al. Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396, doi:10.1167/iovs.04-0349 (2004).
10. Song, B. J., Tsang, S. H. & Lin, C. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).
11. Skeie, J.M. and Mahajan, V.B. Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis http://www.jove.com/details.stp?id=2455 doi: 10.3791/2455. J Vis Exp. 47 (2011).
12. Ciechanowski, K. et al. Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes. Arch Med Res 36, 148-153, doi:S0188-4409(04)00121-3 [pii]10.1016/j.arcmed.2004.11.002 (2005).

8 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.