Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses. J. Vis. Exp. (50), e2795, doi:10.3791/2795 (2011).

마우스 망막은 상속 망막 질환의 중요한 유전 모델로 등장했습니다 동안 마우스 유리는 탐험으로 남아 있습니다. 유리체는 intraocular뿐만 아니라 extraocular 단백질이 질병 중에 축적 망막을 overlying 매우 수성 세포외 기질이다. 유리체와 망막 사이의 ^1-3 비정상적인 상호 작용 이러한 망막 분리, proliferative 당뇨병의 망막 병증, uveitis, 그리고 proliferative vitreoretinopathy과 같은 여러 가지 질병을 기초 ^{1. ,} 마우스 렌즈는 안구의 약 75 % 점유 이후 ⁴ 상대 마우스 유리 볼륨은 인간의 유리 (그림 1)보다 훨씬 작습니다. ^5이 어려운 마우스 유리의 생화 학적 연구를 하였다. 이 동영상이 문서에서 우리는 유전자 변형 마우스 모델의 사용이 더 명확하게 vitreoretinal 질병의 개발이 세포외 기질의 역할을 정의할 수 망막에서 마우스 유리를 해부하다하고 분리하는 기술을 제시한다.

1. 앞쪽에 세그먼트 해부.

1. limbus에 후부 Scleral 조직은 0.22 forcep과 세계 (눈 공) 안정화는 함께 파악합니다.
2. microsurgical 블레이드는 limbus에서 limbus로 각막의 선형 절개를하는 데 사용됩니다.
3. 0.12 콜리 브리 forcep는 다음 절개에서 각막을 파악하는 데 사용됩니다.
4. 앞쪽에 챔버 유체는 다음 샌드위치 - 셀 수술 창으로 흡수됩니다.

2. 렌즈 내장 적출.

1. 각막 쥐고 0.12 콜리 브리 forcep는 세계를 안정화하는 데 사용됩니다.
2. 멋진 곡선 바늘 홀더 (또는 곡선 드레싱 포셉) 지구의 후부 측면 방향으로 렌즈 뒤에 삽입됩니다. 바늘 홀더가 부분적으로 폐쇄하고, 앞으로 가져온 것입니다. 압력이 안구 벽은 그대로 둔 상태에서 각막 절개를 통해 앞으로 렌즈를 못살게 굴지 공막엔의 외부 표면에 포셉를 사용하여 적용됩니다. 유리체는 반투명 젤로 표시하고 렌즈에 부분적으로 자기편이다.
3. 렌즈 - 유리의 조직​​은 다음 PBS에 용해 테아제 억제제 칵테일 (로체) 20 microliters을 포함하는 필터링 원심 분리 튜브에 배치됩니다.

3. 망막의 내장 적출.

1. 각막 절개를 쥐고 0.12 콜리 브리의 집게와 함께 지구를 안정화하기 위해 계속합니다.
2. 멋진 곡선 바늘 홀더 (또는 곡선 드레싱 포셉) 시신경 근처 가능한 세계에까지 후부로 배치됩니다. 바늘 홀더가 부분적으로 폐쇄하고, 앞으로 가져온 것입니다. 압력은 각막 절개를 통해 앞으로 망막들을 못살게 굴지 공막엔의 외부 표면에 포셉를 사용하여 적용됩니다. 유리체가 망막에 자기편 반투명 젤로 나타납니다. 망막은 노란색, vascularized 조직으로 시각이다. 색소 조직의 스트립은 집게로 멀리 벗겨 수 있습니다.
3. 망막 - 유리체 조직은 다음 렌즈 - 유리 조직을 포함하는 필터링 원심 튜브에 배치됩니다.

4. 원심 분리를 필터링.

1. 여과 원심 분리기 튜브는 benchtop의 원심 분리기에 배치됩니다. 12분에 대한 14,000 X G에서 스핀.
2. 유리체있는 하부 챔버에서 eluant을 대기음. 망막은 상부 챔버에 남아 있습니다. 이 샘플은 단백질 연구를 위해 이용하실 수 있습니다.

5. 대표 결과

유리 샘플은 SDS - PAGE (그림 2)에 의해 분석되었다. 샘플은 또한 효소 활동 분석 (그림 3)에 사용되었습니다.

그림 1. 마우스 눈 다이어그램. 인간과 마우스 눈 교차 단면 개략도는 큰 렌즈로 인해 마우스 눈을 상대 작은 유리 볼륨을 보여줍니다.

그림 2. 한 차원 SDS - PAGE 마우스 유리체 및 망막의. 단백질 마우스 유리의 프로필, 13.6 MG / ML (레인 1), 그리고 망막, 11.35 MG / ML (레인 2). 젤 전기 영동은 플라밍고 형광 겔 얼룩 물들일, 45 분 150 KV에서 공연하고 VersaDoc 이미징 시스템 (BioRad, 헤라클레스, CA)를 사용하여 시각되었습니다.

그림 3. 마우스와 인간의 유리체에서 초과 산화물의 dismutase (소드) 효소 활동. 총 소드 활동의 측정 (소드 활동 colorimetric aasay 키트, # AB65354, Abcam, 병원, 캠브리지, MA) 유리와 DBA와 흰둥이 생쥐에서 내장 적출에 의해 수집된 망막에서 수행되었다. 이것은 인간의 유리 코어 및 상대적인 활동을 결정하기 위해 사후 인간 기증자 눈을에서 수집한 인간의 망막에있는 소드 활동에 비해했다. Undiluted 유리체 코어 샘플은 수동으로 23 게이지 바늘, ^11, 망막은 눈 꽃과 거리 RPE / 맥락막 복잡한에서 조직을 절단하여 수집되었습니다을 사용 aspirated했다. 분석은 소드 isoforms 구분하지는 않지만 그것이 유일한 세포 이소형이기 때문에, 유리체 소드 활동, SOD3을 반영 가능성이 ¹² 망막 소드 활동이 세 소드 isoforms을 반영 가능성이 있습니다. 세포내 SOD1, mitochondrial SOD2, 그리고 세포 SOD3가. ^12이 소드 분석을 포함하여 고도로 민감한 효소 assays, 들어, 단백질의 교차 오염의 가능성이 가능하고 추가 연구를 필요로합니다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다.

유전자 변형 생쥐는 망막과 vitreoretinal 질병을 조사하는 중요한 모델입니다. ^6-10는 마우스 유리 본체 그러나, 마우스 눈 속에있는 대형 렌즈로 인한 인간의 유리에 비해 눈 크게 작은 비율로 구성되어 있습니다. ^5이 있습니다 그것은 어려운 마우스 유리를 분리하고 정화합니다. 이러한 proliferative 당뇨성 망막 병증의, 나이 관련 황반 변성, uveitis, 그리고 망막 분리와 같은 질병 중 유리체와 관련된 단백질의 변화를 이해하는 것은 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다 어떤 사람들이 진행하여. 효소 및 proteomic 분석을위한 단백질 수율을 극대화하면서이 시각 실험 프로토콜, 마우스 유리기구를 구하고 정화하기위한 수단을 제공합니다.

동물 실험은 안과 및 비전 연구에 동물의 사용에 대한 안과 정책에 연구 및 비전 협회에 따라 수행되었다.

기금은 시력과 실명을 방지하기 위해 연구 전투에 의해 제공되었다.

1. Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344, doi:S1350-9462(99)00016-6 [pii] (2000).
2. Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. & Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J. Proteome Res. 7, 2516-2525, doi:10.1021/pr800112g (2008).
3. Izuta, H. et al. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).
4. Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).
5. Smith, R. S. in Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods eds R.S. Smith, S.W.M. John, P.M. Nishina, & J.P. Sundberg) 161-195 (CRC Press, 2002).
6. Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E. & Sandberg-Lall, M. Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene. Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).
7. Kaarniranta, K. et al. A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1). Exp. Eye Res. 83, 297-303, doi:10.1016/j.exer.2005.11.027 (2006).
8. Marneros, A. G. & Olsen, B. R. Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).
9. Martin, A. C. et al. Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396, doi:10.1167/iovs.04-0349 (2004).
10. Song, B. J., Tsang, S. H. & Lin, C. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).
11. Skeie, J.M. and Mahajan, V.B. Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis http://www.jove.com/details.stp?id=2455 doi: 10.3791/2455. J Vis Exp. 47 (2011).
12. Ciechanowski, K. et al. Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes. Arch Med Res 36, 148-153, doi:S0188-4409(04)00121-3 [pii]10.1016/j.arcmed.2004.11.002 (2005).

8 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.