Isotermiska Titrering Calorimetry för att mäta makromolekyl-ligand Affinity

Duff, Jr., M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity. J. Vis. Exp. (55), e2796, doi:10.3791/2796 (2011).

Isotermisk titrering kalorimetri (ITC) är ett användbart verktyg för att förstå hela termodynamiska bilden av en bindande reaktion. I biologi, makromolekylära interaktioner är viktiga för att förstå maskineri i cellen. Experimentella förhållanden, som buffert och temperatur kan anpassas till de särskilda bindande system som studeras. Det är dock noggrann planering behövs eftersom vissa ligand och makromolekyl spänner koncentration krävs för att få användbara data. Koncentrationer av makromolekyl och liganden måste fastställas noggrant för tillförlitliga resultat. Försiktighet måste också tas vid upprättandet av prover som föroreningar kan avsevärt påverka experimentet. När ITC experiment, tillsammans med kontroller utförs korrekt, användbar bindande information, såsom de stökiometri, samhörighet och entalpi, erhålls. Genom att köra ytterligare experiment under olika buffert eller temperaturförhållanden, kan mer detaljerad information kan erhållas om systemet. Ett protokoll för den grundläggande installationen av ett ITC experiment ges.

Isotermisk titrering kalorimetri (ITC) är en väletablerad teknik som kan fastställa alla termodynamiska parametrar (affinitet, entalpi och stökiometri) ett bindande interaktion i ett experiment. ¹ ITC fungerar genom att titrera en reaktant i en andra reaktant under isoterma förhållanden. Signalen mäts är den värme som frigörs eller absorberas på interaktion (bindning) av de två reaktanter. En serie injektioner utförs och värmen signalen kommer att närma sig noll som den begränsande reaktant blir mättad. Montering av isoterm ger termodynamiska parametrar. Flera recensioner är tillgängliga som beskriver instrumentering samt matematik för datainsamling och analys. ^2,3 Medan andra kalorimetrar finns (främst ITC ₂₀₀ med små volymer), här beskriver vi en allmän protokoll för VP-ITC tillverkas genom MicroCal (nu en del av GE Healthcare).

1. Förbereda prover

1. I syfte att förbereda makromolekyl och liganden i buffert, vissa tänkbara problem måste lösas. Exakt passar kräver korrekt koncentrationer av makromolekyl, de arter som vanligtvis går i provet cellen av ITC och ligand, arterna i injektionsspruta. Eftersom vissa proteiner samlade vid höga koncentrationer som behövs för arter i injektionsspruta, oftast proteinet laddas in provet cellen. Den optimala makromolekyl Koncentrationen bestäms från "C", en produkt av den förutspådda affinitet av systemet, som kan uppskattas med hjälp av ortogonala metoder innan du använder ITC, och det totala makromolekyl koncentration, där c = K _en * [M]. Optimala värden för C intervall från 1 till 10, ¹ även om det är möjligt att få tillförlitliga uppgifter för svag-bindande system under vissa experimentella förhållanden med c-värden under den nedre gränsen. ⁴ Därför måste makromolekyl koncentrationen bestämmas med denna rad c värden i minnet (dvs för en K _en av 10 ^{6 m -1} bör makromolekyl halter 10 till 1000 mikroM användas). Förkunskap om affinitet av systemet kan hjälpa till att minimera protein som används för ITC genom bättre utformning av ITC experiment. Koncentrationen av liganden bör vara tillräckligt stor (7-25 gånger mer koncentrerad än den _K-d för de svagaste ligandbindande plats) så att mättnaden inträffar inom de första tredjedel till hälften av titrering. Noggrann montering av uppgifterna kräver också mättnad av signalen. För system med högre affinitet, bör en lägre ligand koncentration användas för att undvika mättnad för tidigt i titreringen, vilket ger felaktiga passar. När värmen utspädning styrning (dvs titrering av ligand till buffert) har subtraherats från titreringen bör entalpi vid mättnad närma sig noll.
2. Eftersom småmolekylära föroreningar kan ge upphov till artefaktuella signaler i ITC mätningar är det bäst, om möjligt, att makromolekyl och liganden uttömmande kan dialyseras mot buffert. Alternativt kan kolonnkromatografi, avsaltning snurra kolumner eller buffert utbyte centrifugal-filter (till exempel Centricons) användas för att ändra bufferten av makromolekyl. Om liganden är en liten molekyl, kan det vara berett att använda dialys bufferten efter makromolekyl har dialyseras eller dialyzing mot dialysmembran med cutoffs lämplig för små molekyler (dvs 100-500 Da för ett Spectra / Por Float-A-analysatorn ). Skillnader i bufferten sammansättningen mellan ligand och makromolekyl lösningar kan leda till att signalen artefakter från värmen av utspädningen av föroreningar i proverna. Efter beredning, kontrollera att pH i bufferten, makromolekyl och liganden match (± 0,05 pH-enheter) som artefakter i entalpi kan uppstå på grund buffert protonation effekter. ⁵ Se till att förbereda tillräckligt av varje art. För tre exemplar experiment och en utspädning kontroll kommer den mängd som behövs för material beror på använd ITC. Men för de flesta ITC instrument som har ungefär 2 ml celler volym urvalet, minst 6-7 ml makromolekyl lösning behövs, och kan enkelt upprättas i 15 ml Falcon rör. För 300 mikroliter injektionssprutor, bör 1-2 ml lösning vara adekvata, och kan tillagas antingen falk rör eller rör mikrocentrifug.
3. Damm och andra partiklar, kan orsaka artefakter i baslinjen för ITC termogram. Det är viktigt att de tas bort innan du kör experimentet. Efter beredning av lösningar prov lager, bör proverna centrifugeras i mikrocentrifugrör i fem minuter vid 8000 till 14.000 rpm till pellets partiklar i lösningen. Avlägsna supernatanten, försiktigt så att inte störa pelleten, och placera den i en ny falk / mikrocentrifug rör.
   Om reduktionsmedel behövs för att bibehålla minskad cysteines, använda låga koncentrationer och färska lager av β-Mercaptoethanol, TCEP (tris (2-karboxylgrupp) fosfin) eller ditiotreitol att minimera eventuella artefakter på grund av reduktionsmedel oxidation. Dessutom kan förekomsten av organiska lösningsmedel i bufferten (vanligt för vissa små molekyler ligander som kan behöva metanol eller DMSO för att vara löslig) orsaka signal artefakter. Om organiska lösningsmedel behövs för ligand, då makromolekyl lösningen måste också innehålla samma koncentration för att undvika att någon signal till följd av hetta utspädning av organiska lösningsmedel. Mindre skillnader i buffert sammansättning mellan ligand och makromolekyl grund cosolvents, salter eller pH är möjlig under beredningen av proverna. Det är bäst att kontrollera utspädning av liganden i provet buffert eller provet buffert i makromolekyl att se till att värmen signaler på grund av skillnader i bufferten innehåll inte leda till att data härrör enbart från artefakter.
4. Kontrollera koncentrationerna av de makromolekyl och liganden försiktigt med hjälp av tekniker lämpliga för ditt system (t.ex. absorbansmätningar, HPLC, kolorimetriska analyser, BCA testmetoder för proteiner, etc) för att spela in deras exakta koncentrationer. Skillnader i faktiska koncentrationen och koncentrationen som används för att passa den isoterm kommer att orsaka fel i stökiometri, entalpi och bindningsaffinitet bestäms från experimentet. Det är vanligt att lufta den proverna för att undvika signal artefakter på grund av luftbubblor eller utsläpp av lösta gaser under titreringen, speciellt vid högre temperaturer.

2. Ställa in experimentet

1. Se till att provet cellen och injektionsspruta städas enligt tillverkarens protokollet före lastning i makromolekyl och liganden. Skölj provet cellen två eller tre gånger med 1,8 ml destillerat vatten med Hamilton sprutan (försiktig med Hamilton sprutan som den fat lätt är trasig eller nålen böjd). Nästa Skölj provet cellen flera gånger med 1,8 ml buffert. Ladda provet cellen med 1,8 ml makromolekyl lösning, att vara noga med att undvika bubblor bildas.
2. Fyll referens cell med destillerat vatten. För de flesta buffertar är destillerat vatten bra att använda som referens lösning. För buffertar med särskilt höga joniska styrkor eller osmolalitet, är det bättre att använda bufferten som referens.
3. Avlägsna luftbubblor från referens-och provkuvetterna med Hamilton sprutan. Rör försiktigt nålen på sprutan upp-och-ner på sidorna av cellen knackar några bubblor som kan vara på botten av cellen och bifogas väl till toppen av cellen. Ta bort överflödig volym från provet och celler referens.
4. Bifoga en plastspruta med fylla porten på injektionsspruta med slang. Skölj injektionssprutan med destillerat vatten. Följ med en buffert skölj. Se till att injektionsspruta helt evakueras genom att dra luft genom systemet. Placera nålen på injektionssprutan i ligand lösningen och dra liganden lösningen i injektionssprutan tills hela sprutan är full. Fortsätt att rita ett litet överskott (cirka 50 l eller mer) i porten och fäst slangen. Omedelbart stänga fyllningen hamnen i sprutan och ta bort slangen och plast spruta. Töm och fyll injektionsspruta två gånger för att avlägsna eventuella luftbubblor från sprutan. Ta bort sprutan från liganden lösningen och torka av sidan med en kimwipe att ta bort eventuella droppar, var noga med att inte röra på sprutans topp till kimwipe eftersom detta kan ta bort volymer från sprutan. Var också noga med att inte slå eller burk sprutan som det också kan orsaka förlust av volymen från sprutspetsen. Placera injektionsspruta i provet cellen.
5. Ställ in parametrarna för att köra ITC. För bindande system med stark värme signaler, kommer ett stort antal låg volym injektioner ger mer datapunkter för montering (t ex 75 injektioner av 3 l). För system som har svag värme signaler, ett litet antal stora mängden injektioner är att föredra (exempelvis 33 injektioner av 8 l). Oftast är färre injektioner med högre injektionsvolymer används. Det kan ta flera titreringar för att optimera de förutsättningar som är bäst för ditt system. Det är viktigt att notera att de bindande entalpi antingen kan exoterm eller endoterm, beroende på att systemet som studeras. Tyvärr har vissa system har låg värme-signaler, vilket gör reaktionsvärmet svårt att avgöra. Problem med sådana system kan eventuellt lösas genom att öka koncentrationen av makromolekyl, reglering av temperatur av experimentet (beroende på värmen kapacitet bindande system), och / eller förändra pH eller jonstyrka i bufferten.
6. Tänk också på tiden mellan varje injektion. Det är viktigt att efter varje injektion av ligand är systemet ges tid för att jämvikt och värmen signalen återgår till utgångsläget innan nästa injektion sker. För de flesta system, tre till fem milnutes bör vara tillräckligt. Tiden mellan injektionerna bör ökas för system där jämvikt inte sker inom fem minuter.
7. Eftersom det blir några blandning mellan makromolekyl och lösningar ligand i injektionsspruta när den sätts in i provet cellen, kommer den första injektionen ge felaktiga resultat. Det är bäst att använda små volymer (t ex 2 l) för de första en eller två injektioner (så att de senare kan kastas) och hålla den efterföljande injektioner på önskade värden.
8. Välj temperaturen för försöket (med 25 ° C är den vanligaste, även om temperaturer mellan 2 och 80 ° C kan användas). Det är bäst att välja en temperatur som passar andra experiment (bindning, kinetik, mm) utförs på ligand-makromolekyl systemet. ITC kan ställas in för att utjämna till en annan temperatur än temperaturen i experimentet. Om försöket ska utföras vid en temperatur över 10 ° C från rumstemperatur, då är det bäst att ställa in jämvikt temperaturen för instrumentet inom 5 ° C av den experimentella temperaturen. Detta kommer att minska den tid instrumentet kommer att ta att nå den temperaturen i experimentet.
   Den omrörning hastighet sprutan måste också beaktas. Omrörning är nödvändig för en ordentlig blandning av ligand och makromolekyl under titreringen, men vissa proteiner är destabiliseras genom snabb omrörning. I dessa fall bör omrörning hastigheten ligger på en relativt låg skattesats. När alla de experimentella parametrar som har satts upp, då experimentet kan startas.
9. När experimentet har avslutats kan ITC rengöras enligt tillverkarens protokollet. Lösningen i provet cellen i slutet av experimentet kan hållas om ytterligare experiment på makromolekyl-ligand komplex blandning önskas.
10. Upprepa titreringarna minst en eller två gånger för att få reproducerbara data. Kör en kontroll där ligand titreras i buffert i provet cellen att bestämma värmen utspädning för ligand. För vissa system där en kooperativ bindande, ytterligare information om bindande process kan vinnas genom att injicera makromolekyl i ligand. De olika injektionen inriktningar kan ge ytterligare information som kan vara till hjälp för den globala montering. ⁶

3. Analysera data

1. Montering av data kan enkelt utföras med makron i alla data passande program (vanligtvis från tillverkaren tillsammans med instrumentet). Lägg den första datafil. Kontrollera den råa termogram efter tecken på luftbubblor eller andra artefakter i signalen. Om det finns några artefakter (såsom broddar i baslinjen eller topparna när det inte fanns någon injektion vid denna tidpunkt), anteckna dessa data punkter som de bör tas bort. Därefter laddar liganden uppgifter utspädning kontroll och subtrahera data liganden utspädning från bindningen isoterm. Vid denna tid, ta bort alla falska datapunkter, bland de första en eller två datapunkter av titreringen där utspädning artefakter uppstår (se steg 7).
2. Välj de data som passar modellen (en bindningsställe, två / flera bindningsställen, kooperativa bindande, etc) som ska användas för att passa data. Data kan passa med inledande gissningar om montering parametrar, stökiometri (n), entalpi (ΔH) och affinitet (K _a). Om förkunskaper om affinitet, eller andra parametrar, är känd från ortogonal experiment, då dessa värden kan anges. Detta hjälper till att undvika passar fastnar i lokala minima under montering. När uppgifterna har plats för den första titreringen, upprepa steg 15 och 16 för resten av isotermerna. Alternativt kan data passar globalt med hjälp av program som SEDPHAT. ⁶ SEDPHAT kan vara särskilt användbart i globala montering av binära komplexa datamängder (dvs molekyler A + B) i kombination med ternära komplexa datauppsättningar (molekyler A + B + C). Till exempel i bindningen av molekylen C till ett AB komplex, är det inte alltid klart om det kan finnas någon signal på grund av bindning av C till A eller B till A (om en inte är helt mättad).
3. För att säkerställa att ITC uppgifterna inte artefaktuella bör bindningsaffiniteten och stoichiometries erhållas från ITC ska jämföras med en ortogonal metod. ^7,8 Dessutom kan ITC entalpi värdet jämfört med entalpi från en van't Hoff tomt. ⁹ Det kan också vara bra att använda olika koncentrationer av ligand eller makromolekyl som det absoluta värdet av den värme signalen bör öka med ökande makromolekyl koncentration. Artefakter är mest sannolikt att uppstå om buffertar i cellen och sprutan inte matchas. En annan möjlighet för artefakter uppstår från orena prover.
4. Vi rekommenderar att användaren börja med enkla binära komplexa titreringar som det finns tidigare information finns på K _d och stoichiometry. Sedan, om ytterligare ligander binder, kan användaren försöka mer komplicerat titreringar ternära komplex, varierande liganden koncentrationer, och kanske byta sprutan och komponenter cell. En jämförelse av enthalpies för både vägar till ternära komplexbildning bör tillsats som entalpi är en statlig funktion. ¹⁰ Återigen är SEDPHAT ⁶ sannolikt att vara ganska bra här.

4. Representativa resultat:

Figur 1. Ett representativt exempel på en skötsam titrering för bindningen av kofaktor NADPH till E. coli kromosomal dihydrofolatreduktas (ecDHFR). Panel (A) uppvisar den obehandlade termogram, (B), bindande isotermen från den integrerade termogram passar med en plats modell i Ursprung mjukvaran, och (C) passar för isoterm med en bindningsstället modell från SEDPHAT längs med plats restprodukter. Från Ursprung programvaran, med hjälp av en webbplats bindande modell, n = 1,09 ± 0,02, K _d = 0,194 ± 0,001 mikroM, ΔH = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13,1 ± 0,4 kcal / mol, och ΔG = - 9,16 ± 0,01 kcal / mol. Passar för data med hjälp Sedphat råd med ett n på 0,94 ± 0,01, en ​​K _d av 0,195 ± 0,013 ΔM, en ΔH av -22,5 ± 0,2 kcal / mol, TΔS av -13,39 kcal / mol och ΔG för -9,15 kcal / mol.

ITC har använts i stor utsträckning för att studera interaktioner ligand makromolekyl, ¹¹ med undersökningar av protein-ligand, ¹² DNA-ligand ¹³ och RNA-makromolekyl ¹⁴ studier. ITC kan även drivas med fasta material, som t.ex. nanopartiklar, som bildar enhetliga suspensioner. ¹⁵ Vidare kan ternära system, där en ligand redan är bunden till makromolekyl och en andra ligand titreras, användas för att bestämma termodynamik, för Exempelvis kan bindning av substrat till ett enzym-kofaktor systemet. ⁷ Studier även utföras för molekyler med mycket hög bindningsaffiniteter som normalt skulle överskrida detektionsgräns ITC genom att utföra konkurrens bindande analyser med svagare bindning ligander. ¹⁶ Information om svagt bindande ligander kan också fås av konkurrens-analyser. ¹⁷ vattnets roll i bindande kan utforskas genom ITC, ¹⁸ tillsammans med beroendet av entalpi om lösningsmedlet omorganisation. ¹⁹ Nyligen var termodynamik conformationaländring av DNAK varianter mäts vid bindning av ADP och ATP. ²⁰ Protein-protein föreningen kan studeras genom ITC, vilket ger information om Hetero komplex ²¹ samt på homo-föreningen. ²² Temperatur effekter på bindande entalpi ger värmen kapacitet bindande händelsen. ² Antalet protoner absorberas eller frigörs vid bindning kan också bestämmas från experiment som utförs i buffertar med olika enthalpies av jonisering. ⁵ Om ytterligare ITC studier är gjorda vid olika pH-värden, då pKa av de aktuella gruppen kan eventuellt fastställas. ²³

Sammanfattningsvis exakta mätningar av koncentrationen av makromolekyl och liganden är absolut nödvändigt för en bra ITC experiment. Exempel på koncentrationer måste också vara inom en lämplig intervall för att få tillförlitliga uppgifter. Försiktighet bör iakttas med buffert så liten molekyl orenheter och obalanser pH kommer att orsaka artefakter i termogram.

Inga intressekonflikter deklareras.

Detta arbete stöddes av NSF bevilja MCB-0.817.827.

1. Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J.F., & Lin, L.N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Anal. Biochem. 179, 131-137 (1989).
2. Jelesarov, I. & Bosshard, H.R. Isothermal titration calorimetry and differential scanning calorimetry as complementary tools to investigate the energetics of biomolecular recognition. J. Mol. Recognit. 12, 3-18 (1999).
3. Velazquez-Campoy, A., Leavitt, S.A., & Freire, E. Characterization of protein-protein interactions by isothermal titration calorimetry. Methods Mol. Biol. 261, 35-54 (2004).
4. Turnbull, W.B. & Daranas, A.H. On the value of c: can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry? J. Am. Chem. Soc. 125, 14859-14866 (2003).
5. Fukada, H. & Takahashi, K. Enthalpy and heat capacity changes for the proton dissociation of various buffer components in 0.1 M potassium chloride. Proteins. 33, 159-166 (1998).
6. Houtman, J.C., et al. Studying multisite binary and ternary protein interactions by global analysis of isothermal titration calorimetry data in SEDPHAT: application to adaptor protein complexes in cell signaling. Protein Sci. 16, 30-42 (2007).
7. Bradrick, T.D., Beechem, J.M., & Howell, E.E. Unusual binding stoichiometries and cooperativity are observed during binary and ternary complex formation in the single active pore of R67 dihydrofolate reductase, a D2 symmetric protein. Biochemistry. 35, 11414-11424 (1996).
8. Shenoy, S.R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chem. Biol. 9, 1109-1118 (2002).
9. Chopra, S., Lynch, R., Kim, S.H., Jackson, M. & Howell, E.E. Effects of temperature and viscosity on R67 dihydrofolate reductase catalysis. Biochemistry. 45, 6596-6605 (2006).
10. Norris, A.L. & Serpersu, E. Interactions of Coenzyme A with the Aminoglycoside Acetyltransferase (3)-IIIb and Thermodynamics of a Ternary System. Biochemistry. 49, 4036-4042 (2010).
11. Falconer, R.J., Penkova, A., Jelesarov, I., & Collins, B.M. Survey of the year 2008: applications of isothermal titration calorimetry. J. Mol. Recognit. 23, 395-413 (2010).
12. Ababou, A. & Ladbury, J.E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. J. Mol. Recognit. 20, 4-14 (2007).
13. Buurma, N.J. & Haq, I. Advances in the analysis of isothermal titration calorimetry data for ligand-DNA interactions. Methods. 42, 162-172 (2007).
14. Salim, N.N. & Feig, A.L. Isothermal titration calorimetry of RNA. Methods. 47, 198-205 (2009).
15. De, M., You, C.C., Srivastava, S., & Rotello, V.M. Biomimetic interactions of proteins with functionalized nanoparticles: a thermodynamic study. J. Am. Chem. Soc. 129, 10747-10753 (2007).
16. Velazquez-Campoy, A. & Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nat. Protoc. 1, 186-191 (2006).
17. Velazquez Campoy, A. & Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophys. Chem. 115, 115-124 (2005).
18. Harries, D., Rau, D.C., & Parsegian, V.A. Solutes probe hydration in specific association of cyclodextrin and adamantane. J. Am. Chem. Soc. 127, 2184-2190 (2005).
19. Chervenak, M.C. & Toone, E.J. A direct measure of the contribution of solvent reorganization to the enthalpy of binding. J. Am. Chem. Soc. 116, 10533-10539 (1994).
20. Taneva, S.G., Moro, F., Velazquez-Campoy, A., & Muga, A. Energetics of nucleotide-induced DnaK conformational states. Biochemistry. 49, 1338-1345 (2010).
21. Jelesarov, I. & Bosshard, H.R. Thermodynamics of ferredoxin binding to ferredoxin:NADP+ reductase and the role of water at the complex interface. Biochemistry. 33, 13321-13328 (1994).
22. Burrows, S.D., et al. Determination of the monomer-dimer equilibrium of interleukin-8 reveals it is a monomer at physiological concentration. Biochemistry. 33, 12741-12745 (1994).
23. Baker, B.M. & Murphy, K.P. Evaluation of linked protonation effects in protein binding reactions using isothermal titration calorimetry. Biophys. J. 71, 2049-2055 (1996).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.