卵巣と卵管の三次元器官培養用アルギン酸ゲル

1。卵巣解剖と組織の分離

1. アルギン酸ナトリウムの0.5％（w / v）の溶液を調製、プロトコールの修正版から準備滅菌PBS、37への熱℃を使用して、これまで⁵に記載反転またはロッキングによるミックスが、ボルテックスしないでください。 25 Gの針を1mlのシリンジにアルギン酸を描画し、37℃に維持
2. 架橋組織のカプセル化時にアルギン酸および37に暖かい℃で10mMの無菌CaCl ₂溶液を準備
3. 各実験のための24ウェルプレートにウェル当たりの培地1mLの（αMEM+ 5単位ペニシリン、5μg/ mlのストレプトマイシン）を準備する。種々の薬物、ペプチド、または培養液中のウイルスが含まれています。前の臓器のカプセル化にトランスフェクションのために、37℃で4時間のリポフェクトアミン2000とプラスミドDNAと組織をインキュベート
4. 動物から臓器を解剖し、任意の脂肪や残存組織を除去する、軽く卵巣周囲の嚢の膜をやってのける、とオルガンを二分することによって4つの部分に卵巣や卵管をカット。動物を頸部脱臼に続いてCO ₂窒息により安楽死させた。卵管の場合は、軽く結ぶ膜を離れて引っ張り、切断する前にピンセットを使用して反対方向にチューブの端を拡張することによって組織を解く。
5. 滅菌メッシュ繊維の上に単一のアルギン酸の液滴（〜1月3日μL）を置きます。
6. 滅菌ピンセットを使用して、アルギン酸の液滴と中央に鉗子を用いて液滴または無菌の注射針を臓器の一部を移動する。
7. 滅菌ピンセットでメッシュの繊維を把握し、重力のハンギングドロップにアルギン酸を強制的に許可するように上下逆さまにそれを回して、臓器の一部（オルガノイド）を含む液滴を反転。
8. ドロップは、溶液中に入るように10mMのCaCl ₂溶液を含む10cmのペトリ皿の端に鉗子をタップします。
9. 2分間インキュベートし、培地中に余分な10mMのCaCl _2で 、転送を解放するために毛穴を含有する滅菌スプーンで取り除く。最大4つのアルギン酸ゲルへの培地を含む24ウェルプレートの1ウェルに移すことができます。定義された期間のための文化。

2。細胞のアルギン酸とコレクションの劣化

1. アルギン酸ゲルの可溶化のために、リーボビッツのL - 15 37メディア℃で30分間またはゲルが完全に溶解するまで、Cに溶解したアルギン酸リアーゼの文化（3.4 mg / mL）をインキュベートする。
2. アルギン酸リアーゼから組織を削除します。
3. OSEのコレクションの場合、1時間⁸リーボビッツのL - 15メディアにおけるコラゲナーゼの500台とオルガノイドをインキュベートする。 1分1秒パルス（1秒間ボルテックスし、1秒休息）に続いて1分間ミディアムパワーで2秒のパルス（2秒ボルテックスし、2秒休息）、の渦。臓器片はマイクロ遠心チューブと新しい滅菌マイクロ遠心チューブに上清をピペットの底に落としてください。ペレットの卵巣の表面上皮に3000 rpmで3分間遠心操作する。
4. 卵管上皮のコレクションの場合、5単位のペニシリン、5μg/ mlのストレプトマイシン、4％（v / v）のFBSを含むDMEM中で組織培養プラスチック上縦チューブをカットし、場所。 3-5日にわたり、細胞は卵管間質から"クロール"し、組織培養plastic9に成長する。

3。パラフィン切片用アルギン酸カプセル化された器官培養の固定

1. 選択した時点で培養液からビーズをカプセル化アルギン酸を収集する。
2. 2分間滅菌した10mMのCaCl ₂溶液中に文化をドロップすることによってゲルを堅くするアルギン酸をRecrosslink。
3. ゲルは固体のまま、完全に固定の間組織をカプセル化することを確実に50 mMスクロース、10mMのCaCl ₂及び50mMのカコジル酸ナトリウムを含有する2％パラホルムアルデヒドでアルギン酸カプセル化された臓器を修正。
4. 組織の処理に続いて、5μmのセクションを生成するためにミクロトームでパラフィンやセクションに全体のアルギン酸でカプセル化された器官培養片を埋め込みます。
5. アルギン酸塩を溶解し、ベースの抗原の検索を加熱するため、免疫組織化学を実行する場合は、スライドから削除されます。アルギン酸塩が残っていると立ってヘマトキシリン​​とエオシン染色でエオジンのために染色される。

4。代表的な結果：

卵巣と卵管の三次元器官培養の例を図1に示されています。卵巣は、異なる大きさの片に切断し、OSEは増殖し、メスで切開から負傷した表面を修復するために移行することができます。このプロセス中に、基盤となる間質に対する相対OSEの正しい向きは、卵巣をカプセル化しているOSEで、維持されます。図2に示すように、四半期またはeighthsにカット卵巣に比べて、半分にカット卵巣のOSEは、より完全に卵巣をカプセル化します。卵巣の傷の修復表面は全体の卵巣の文脈で検討することができ、排卵と表面修復が卵巣の表面の変形を誘導する方法に光を当てることができる。

実験のエンドポイントが必要とされる情報によって異なります。組織構造、細胞形態、および特定の細胞の成長率は、簡単にパラフィン切片を使用して監視されます。 7日間、5μg/ mlのインスリンの添加が、卵巣の表面上皮との複数の層の形成の過剰増殖を誘導しながら例えば、卵巣の表面上皮の単層は、7日間（図3A）の無血清αMEMで培養後に観察され細胞（図3B）。固定前に10μMの24時間の最終濃度で培養物にブロモデオキシウリジンを追加することによって、細胞の増殖は（挿入図3Aおよび3B）を測定することができます。顆粒膜細胞の割合が大きく、増殖しながら、無血清αMEMで維持培養のため、OSEの約3〜5％が、24時間の標識期間（挿入図3A）の間に増殖を受ける。培地にインスリンを添加すると、合計OSE（挿入図3B）の約30％にOSEを増殖の割合が高くなります。緑色蛍光タンパク質（GFP）の免疫蛍光は、cDNAをトランスフェクション（図3C）は、次の標準的な顕微鏡とアルギン酸ゲルを介して可視化することができます。アルギン酸の器官培養では卵巣の表面上皮と一次卵胞の成長と分析のために提供していますが、それは成熟した、二次卵胞は、この培養系（図3D）で生き残るために失敗することに留意すべきである。アルギン酸ハイドロゲルマトリックス内に満期までの個々の卵胞の培養は、他の場所で¹⁰記載されている。

タンパク質やRNAの変化は、全体の臓器または酵素的分解（図4）を使用して特定の細胞型から分析することができます。一部の間質細胞はまた、（図4D）絶縁されているものの、コラゲナーゼと培養卵巣オルガノイドの治療は、ペレットは、以下の処置を得られた細胞のOSEの濃縮を可能にしながら（図4C）無傷の基本的な間質を残します。

負傷後のOSEを伝播するために使用される図1。マウスの卵巣三次元培養システム。 A）顕微鏡下では、嚢と周囲の脂肪パッドは削除されました。 B）はそのまま卵管チューブと卵巣（O）（T）と脂肪パッド（F）。 C）ブルサと脂肪パッドで卵巣を除去（左）と巻かれていない卵（右）。 D）卵巣や卵管オルガノイドは、アルギン酸の液滴に入れた。 E）アルギン酸包まオルガノイドは、CaCl ₂溶液に架橋ゲルを形成するために、アルギン酸塩に滴下した。 F）アルギン酸カプセル化された卵巣オルガノイドは。 G）アルギン酸は、卵管オルガノイドをカプセル化。 H）アルギン酸カプセルオルガノイドは、培養培地中でインキュベートした。

図2表面領域は、サイトケラチン8によって測定された卵巣の表面が再生成されます。 eighths、四半期、半分にカットされた後、OSEによる卵巣オルガノイドのカプセル化は、BSA培地で培養し、サイトケラチン8（CK8）抗体を用いた免疫組織化学分析により測定。

図3。アルギン酸の培養系は、成長因子の通過とOSEへのcDNAのトランスフェクションすることができますが、卵胞の急速な成長と成熟を ​​サポートしていません。 A）卵巣オルガノイドは、OSEをマークCK8表現、について分析した基礎培地で7日間培養。はめ込み、シリアルセクションでは、BrdUの取り込みのために染色。 B）培地にインスリンの添加は、OSEの過形成を誘導する。はめ込み、シリアルセクションでは、BrdUの取り込みのために染色。 C）卵巣オルガノイドは、GFPを発現するようにするcDNAでトランスフェクション。 D）アルギン酸の培養系は、原始卵胞（赤矢印）の成長をサポートしますが、成熟していない二次卵胞（黒矢印）。

図4。OSEは、培養後分析のために単離することができる。 A）オルガノイドは最大2週間のための培地で培養する。 B）カプセル化オルガノイドは、オルガノイドをそのままにしておくアルギン酸リアーゼと扱われます。卵巣は、OSEをマークするCK8で染色される。 C）オルガノイドは、基礎となる間質からOSEを分離するコラゲナーゼで処理される。残りの組織片は、卵巣表面の除去を強調するためにCK8で染色した。 CK8（赤）を染色としてD）処理後に回収した細胞は、OSEのために濃縮されます。細胞は核をマークするためにDAPIで対比されています。

アルギン酸ハイドロゲルを利用した三次元器官培養系の開発は、生物の多種多様な多くの異なる組織型を分析するための汎用的な方法を表します。それは細胞が^11を成長することのできる足場を提供するので、3次元培養の使用は、組織工学と再生医療の分野に拡張することができます。現在、私たちの研究室ではヒト卵巣と卵管組織を用いた初期の研究が行われているが、ヒトおよび非ヒト霊長類卵胞の培養は^、12,13に記載されている。

文化のオルガノイドにアルギン酸ハイドロゲルの使用は、それらの取り入れコラーゲン、フィブリン、またはヒアルロン酸のようなハイドロゲルの他のタイプに比べていくつかの利点を、提供しています。室温、中性pHでのアルギン酸塩ゲル、ゲルがオルガノイド¹⁴カプセルとして組織するために少し混乱を提供する。アルギン酸は、組織の成長の⁵の化学的に不活性なサポートを提供し、細胞タンパク質とは反応しない。ゲルは培養細胞¹⁵の検索を可能にする、カプセル化された組織を分解しない酵素的に分解用いたアルギン酸リアーゼ、することができます。三次元組織培養のためのアルギン酸ハイドロゲルの利用の一つの欠点は、ハイドロゲルの機械的支持を提供してイオン架橋が固定前^5〜限られた文化の期間とアルギン酸の再架橋を必要と、時間の経過とともに安定性が失われるということです。このプロトコルの重要な側面は、文化のプロセスを通して無菌性を維持するだけでなく、卵巣の注意深い解剖と組織の形態に中断を防ぐために卵管組織されています。

従来の細胞培養プラスチック上で培養卵巣の表面上皮が急速にSV40 T / T抗原またはテロメラーゼ¹⁶の発現により不死化されない限り、例えば、間葉移行、形態学的変化、および細胞死に上皮受けるため卵巣と卵管は特に^、この方法に適しています^17。プラスチック上の通常のOSEの成長不良は、潜在的に前癌変化の解析を妨げている。器官培養系でもcells18の正常および悪性の生理学の役割を果たすことが基本的な間質細胞との接触で卵巣表層上皮または卵管上皮の成長をサポートしています。アルギン酸ヒドロゲルのこれらの組織型の文化は、ゲル自体は^5個の細胞と相互作用していない一方、組織の3次元構造を維持するために機械的なサポートを提供しています。

培養卵巣表層上皮または卵管上皮のためにこのメソッドを使用すると、文化の孤立操作に起因する分子と形態学的変化の解析が可能になります。アルギン酸ハイドロゲルシステムは、トランスフェクトしたcDNAは、siRNA、およびshRNAを、だけでなく、ホルモン、成長因子¹⁹の自由な通行を許可します。この細胞型は、高いトランスフェクション効率がこのような顆粒膜細胞として卵巣の内部で他の細胞型に比べOSEで達成されるオルガノイドの外面上にあるため、一過性のトランスフェクションは、OSEのための特定ではないが。実験条件に対応して細胞増殖の変化をモニタリングすることにより細胞を割って培養期間のラベル中のブロモデオキシウリジンの取り込み。 RNAまたはタンパク質レベルでの分子の変化は、腫瘍性変化につながるメカニズムを解明するために決定することができます。

卵巣癌の正確な病因は不明だが、一生の排卵数の増加は、卵巣癌²⁰のリスク増加と相関することが示されている。卵巣癌に排卵を結ぶ仮説のin vivo解析では性腺刺激ホルモン、増殖、および発癌^21から23への炎症の貢献を決定する上で多くの課題を提示。卵巣と卵管のアルギン酸ハイドロゲルの文化が卵巣癌の起源と正常細胞から腫瘍への進行についての新しい情報につながる、卵巣の表面上皮と卵管上皮におけるこれらの各コンポーネントの孤立、直接比較することができます。