Alginat Hydrogele für Three-Dimensional Organ Culture der Eierstöcke und Eileitern

1. Eierstockkrebs Dissektion und Gewebe isoliert

1. Bereiten Sie eine 0,5% (w / v) Lösung von Natriumalginat, aus einer modifizierten Version des Protokolls vorzubereiten zuvor beschrieben ^5, mit sterilem PBS und Hitze bis 37 ° C. Mix durch Umdrehen oder rockig, aber nicht vortexen. Zeichnen Sie das Alginat in eine 1 ml Spritze mit einer 25 G Nadel und halten bei 37 ° C.
2. Bereiten 10mM sterile CaCl _2-Lösung für die Vernetzung der Alginat auf Gewebe Verkapselung und warm bis 37 ° C.
3. Bereiten Sie 1ml Kulturmedium (αMEM + 5 Einheiten Penicillin und 5 ug / ml Streptomycin) pro Well in einer 24-Well-Platte für jedes Experiment. Include verschiedenen Wirkstoffen, Peptiden, oder Viren in das Kulturmedium. Für die Transfektion vor Organ-Verkapselung, inkubieren Gewebe mit Lipofectamine 2000 und Plasmid-DNA für 4 Stunden bei 37 ° C.
4. Präparieren Sie die Organe des Tieres, entfernen Sie alle Fett-oder Restgewebe, ziehen Sie die Bursa Membran umgibt den Eierstöcken, und schneiden Sie den Eierstock oder Eileiter in vier Teile durch Halbierung der Orgel. Die Tiere wurden durch CO _2-Erstickung durch Genickbruch folgte eingeschläfert. Für den Eileiter, sanft abrollen das Gewebe durch Auseinanderziehen der Verbindung Membranen und zur Verlängerung der Enden der Röhre in entgegengesetzter Richtung mit einer Pinzette vor dem Schneiden.
5. Legen Sie eine einzelne Alginat Tröpfchen (~ 1-3 ul) auf eine sterilisierte Mesh-Faser.
6. Mit einer sterilen Pinzette bewegen ein Stück Orgel in die Alginat-Tröpfchen und in der Mitte des Tropfens mit einer Pinzette oder einer sterilen Nadel.
7. Kehren Sie die Tröpfchen mit dem Orgelstück (organoide) durch Ergreifen des Mesh-Faser mit einer sterilen Pinzette und drehen sie auf den Kopf, damit die Schwerkraft auf das Alginat in einen hängenden Tropfen Kraft.
8. Tippen Sie auf der Zange am Rande einer 10cm Petrischale mit 10 mM CaCl _2-Lösung, so dass die Tropfen fällt in Lösung.
9. Inkubieren für 2 Minuten, mit einer sterilen Löffel, die Poren zu zusätzlichen 10 mM CaCl _2, und Transfer in das Kulturmedium Version entfernen. Bis zu vier Alginatgele können in einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Platte mit dem Kulturmedium übertragen werden. Kultur für einen definierten Zeitraum.

2. Der Abbau von Alginat und Ansammlung von Zellen

1. Für die Solubilisierung der Alginatgel, inkubieren Sie die Kulturen in Alginat-Lyase (3,4 mg / ml) in Leibovitz L-15 bei 37 ° C gelöst für 30 Minuten oder bis Gel vollständig gelöst ist.
2. Entfernen Sie das Gewebe aus der Alginat-Lyase.
3. Für Sammlung der OSE, inkubieren die organoiden mit 500 Einheiten Kollagenase in Leibovitz-15 L Medium für 1 Stunde ^8. Vortex in 2 Sekunden Impulse (2 Sekunden vortexen und 2 Sekunden Pause) mit einer mittleren Leistung für 1 Minute, um 1 Sekunde Pulse (1 Sekunde Wirbel und 1 Sekunde Pause) für 1 Minute. Lassen Orgelstücke fallen nach unten Mikrozentrifugenröhrchen und Pipette Überstand in frische sterile Mikrozentrifugenröhrchen. Centrifuge 3 Minuten bei 3000 rpm für Pellet Eierstock Oberflächenepithel.
4. Zum Sammeln der Eileiter Epithel, die Leitung der Länge und Platz auf Gewebekulturen aus Kunststoff in DMEM mit 5 Einheiten Penicillin und 5 ug / ml Streptomycin und 4% (v / v) FBS. Im Laufe von 3-5 Tagen, werden die Zellen "Crawling" aus dem Eileiter Stroma und wachsen auf Gewebekulturen plastic9.

3. Fixation von Alginat verkapselten Organkulturen für Paraffinschnitte

1. Sammeln Sie die Alginat verkapselten Kügelchen aus dem Kulturmedium an ausgewählten Zeitpunkt.
2. Recrosslink das Alginat, das Gel durch Verzicht auf die Kultur in sterile 10 mM CaCl _2-Lösung für zwei Minuten zu versteifen.
3. Fix das Alginat verkapselten Orgel in 2% Paraformaldehyd mit 50 mM Saccharose, 10 mM CaCl ₂ und 50 mM Natriumcacodylat um sicherzustellen, dass das Gel fest bleibt und vollständig kapselt Gewebe während der Fixierung.
4. Nach Gewebe Verarbeitung, betten die gesamte Alginat verkapselten Organkultur Stück in Paraffin und Abschnitt mit einem Mikrotom bis 5 um Abschnitte zu erzeugen.
5. Das Alginat wird aufgelöst und entfernt die Folie, wenn die Durchführung der Immunhistochemie durch basieren Antigen-Retrieval Wärme. Das Alginat wird bleiben und Flecken für Eosin unter stehenden Hämatoxylin und Eosin Färbung.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Ein Beispiel für eine dreidimensionale Organkultur des Eierstocks und Eileiters ist in Abbildung 1 dargestellt. Eierstöcke können in verschiedene Stücke geschnitten werden, und OSE wuchern und migrieren an die Oberfläche, die aus dem Schnitt mit dem Skalpell verletzt wurde repariert. Während dieses Prozesses ist die richtige Ausrichtung der OSE in Bezug auf das darunter liegende Stroma gepflegt, mit der OSE Kapselung der Eierstock. Wie in Abbildung 2 gezeigt, kapseln die OSE von Ovarien in zwei Hälften geschnitten Eierstock mehr vollständig zu Eierstöcke in Viertel oder Achtel schneiden im Vergleich. Die Wundheilung der ovariellenFläche kann im Rahmen des gesamten Ovars untersucht werden und kann Licht auf, wie Eisprung und Oberfläche Reparatur induziert Eierstock-Transformation zu vergießen.

Der Endpunkt des Experiments hängt von den Informationen, die erforderlich ist. Tissue-Architektur, zelluläre Morphologie und spezifische zelluläre Wachstumsraten sind leicht überwacht mit Paraffinschnitten. Zum Beispiel ist eine einzelne Schicht von Eierstock Oberflächenepithel nach Kultivierung in serumfreiem αMEM für 7 Tage (Abbildung 3A) beobachtet, während Zusatz von 5 mg / ml Insulin für 7 Tage induziert Hyperproliferation der ovariellen Oberflächenepithel und die Bildung von mehreren Schichten Zellen (Abbildung 3B). Durch die Zugabe von Bromdesoxyuridin zu den Kulturen in einer Endkonzentration von 10 uM 24 Stunden vor der Fixierung kann die Proliferation von Zellen gemessen (siehe Einschub 3A und 3B) werden. Für Kulturen in serum-freien αMEM erhalten, durchlaufen etwa 3-5% der OSE Proliferation während der 24-Stunden-Kennzeichnung Zeitraum (kleines Bild 3A), während ein größerer Prozentsatz der Granulosazellen vermehren. Die Zugabe von Insulin zu den Kulturmedien steigt der Anteil der proliferierenden OSE auf ca. 30% der gesamten OSE (kleines Bild 3B). Immunfluoreszenz des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) visualisiert werden kann durch die Alginatgel mit Standard-Mikroskopie folgende cDNA-Transfektion (Abbildung 3C). Während Alginat Organkultur bietet für Wachstum und Analyse der ovariellen Oberflächenepithel und Primärfollikel, darauf hinzuweisen, dass die reifen, sekundäre Follikel in dieser Kultur (Abbildung 3D) überleben scheitern. Kultur der einzelnen Follikel zur Reife in einem Alginat Hydrogelmatrix wurde an anderer Stelle ¹⁰ beschrieben.

Änderungen im Protein-oder RNA kann aus dem gesamten Organ oder von bestimmten Zelltypen mit enzymatischen Abbau (Abb. 4) analysiert werden. Die Behandlung von kultivierten Eierstock Organoide mit Collagenase verlässt das darunter liegende Stroma intakt (Abb. 4C) und ermöglicht für die Anreicherung von OSE in der Zelle erhaltene Pellet nach der Behandlung, obwohl einige Stromazellen auch isoliert sind (Abbildung 4D).

Abbildung 1. Maus Eierstock dreidimensionale Kultursystem zur OSE nach der Verwundung zu propagieren. A) Unter dem Mikroskop wurden die Bursa und die umliegenden Fettpolster entfernt. B) Intact Ovar (O) mit Eileiter Rohr (T) und Fettpolster (F). C) Ovar mit Bursa und Fettpolster entfernt (links) und abgewickelt Eileiter (rechts). D) Eierstock-oder Eileiter Organoide wurden in einem Alginat Tropfen gelegt. E) Alginat umhüllt Organoide wurden in eine CaCl _2-Lösung Vernetzung der Alginat zu einem Gel gesunken. F) Alginat Eierstock organoide gekapselt. G) Alginat Eileiter organoide gekapselt. H) Alginat verkapselten Organoide in Kulturmedium inkubiert.

Abbildung 2. Fläche von Eierstock-Oberfläche von Cytokeratin 8 gemessen regeneriert. Verkapselung von Eierstock-Organoide von der OSE, nachdem sie in Achtel, Viertel und Hälften, kultiviert in BSA Medium, gemessen und durch immunhistochemische Analyse mit Cytokeratin 8 (CK8) Antikörper geschnitten.

Abbildung 3. Alginat Kultur ermöglicht Durchgang von Wachstumsfaktoren und Transfektion von cDNA in die OSE, aber nicht unterstützt schnelles Wachstum und Reifung der Follikel. A) Ovarian organoide für 7 Tage in Basalmedium für CK8 Ausdruck, welche die OSE Marken analysiert kultiviert. Inset, Serials Abschnitt für BrdU-Einbau gefärbt. B) Die Zugabe von Insulin zu den Kulturmedien induziert Hyperplasie der OSE. Inset, Serials Abschnitt für BrdU-Einbau gefärbt. C) Ovarian organoide mit cDNA für GFP exprimieren, transfiziert. D) Alginat Kultur-System unterstützt Wachstum der Primordialfollikel (rote Pfeilspitze), aber noch nicht ausgereift Sekundärfollikel (schwarzer Pfeil).

Abbildung 4. OSE kann für die Analyse folgende Kultur isoliert werden. A) Organoide in Medium für bis zu 2 Wochen kultiviert. B) Encapsulated organoide ist mit Alginat-Lyase zu verlassen organoide intakt behandelt. Eierstock ist mit CK8 zu markieren OSE gefärbt. C) Organoide mit Kollagenase zu trennen OSE aus den zugrunde liegenden Stroma behandelt. Verbleibende Gewebestück wurde mit CK8 gebeizt, um die Entfernung der Eierstöcke Oberfläche hervorzuheben. D) gewonnenen Zellen nach der Behandlung sind für OSE angereichert für CK8 (rot) gefärbt. Die Zellen werden mit DAPI gegengefärbt, um Kerne zu markieren.

Die Entwicklung eines dreidimensionalen Organkultursystem Nutzung Alginat-Hydrogele stellt eine vielseitige Methode für die Analyse von vielen verschiedenen Gewebetypen aus einer Vielzahl von Organismen. Der Einsatz von 3D-Kulturen können die Felder des Tissue Engineering und der regenerativen Medizin erweitert werden, da sie ein Gerüst, auf dem Zellen ¹¹ wachsen kann zur Verfügung stellt. Derzeit ist unser Labor unterzogen erste Studien mit menschlichen Eierstock-und Eileiter Gewebe, aber Kultur der menschlichen und nicht-menschlichen Primaten Follikel wurde ^12,13 beschrieben.

Der Einsatz von Alginat-Hydrogele zur Kultur Organoide bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Arten von Hydrogelen, wie die Einbeziehung Kollagen, Fibrin oder Hyaluronsäure. Alginat-Gele bei Raumtemperatur und neutralem pH-Wert und bietet für kleine Störung des Gewebes, wie das Gel kapselt die organoiden ^14. Alginat nicht mit zellulären Proteinen reagieren und bietet eine chemisch inerte Unterstützung für tissue growth ^5. Das Gel kann enzymatisch abgebaut mit Alginat-Lyase, die nicht verschlechtert das verkapselte Gewebe werden, so dass für den Abruf von kultivierten Zellen ^15. Ein Nachteil der Verwendung von Alginat-Hydrogele zur dreidimensionalen Gewebekultur ist, dass die ionische Vernetzung bieten mechanische Unterstützung für das Hydrogel Stabilität verliert im Laufe der Zeit notwendig begrenzte Zeiträume Kultur und Re-Vernetzung der Alginat vor der Fixierung ^5. Kritische Aspekte dieses Protokolls sind Aufrechterhaltung der Sterilität der gesamten Kultur-Prozess, sowie sorgfältige Präparation des Eierstock-und Eileiter Gewebe zu Störungen der Gewebemorphologie verhindern.

Der Eierstock und Eileiter sind besonders für diese Methode geeignet, da Eierstock Oberflächenepithel auf traditionellen Zellkultur Kunststoff kultivierten schnell durchläuft Epithelzellen zu mesenchymale Transition, morphologischen Veränderungen und Zelltod, es sei denn verewigt, zum Beispiel durch Expression von SV40 T / t-Antigen oder hTERT ^{16, 17.} Schlechte Wachstum von normalen OSE auf Kunststoff verhindert Analyse von potenziell prä-maligne Veränderungen. Die Organkultur System unterstützt auch das Wachstum der Eierstöcke oder Eileiter Oberflächenepithel Epithel in Kontakt mit dem zugrunde liegenden Stroma-Zellen, die eine Rolle in der normalen und malignen Physiologie des cells18 spielen können. Kultur dieser Gewebetypen in Alginat-Hydrogele bietet mechanische Unterstützung für die dreidimensionale Architektur des Gewebes zu erhalten, während das Gel selbst nicht mit den Zellen ⁵ interagieren.

Mit dieser Methode zur Kultivierung von Eierstock-Oberflächenepithel oder Eileiter Epithel erlaubt die Analyse der molekularen und morphologischen Veränderungen, die sich aus isolierten Manipulationen der Kultur. Das Alginat-Hydrogel-System erlaubt eine freie Passage der transfizierten cDNA, siRNA und shRNA sowie Hormone und Wachstumsfaktoren ^19. Während die transiente Transfektion ist nicht spezifisch für die OSE, da dieser Zelltyp ist auf der äußeren Oberfläche des organoiden höhere Transfektionseffizienz ist in der OSE erreicht im Vergleich zu anderen Zelltypen in das Innere des Eierstocks, wie Granulosazellen. Der Einbau von Bromdesoxyuridin während der Anzucht Etiketten teilenden Zellen durch die Überwachung der Änderungen in das zelluläre Wachstum in Reaktion auf experimentelle Bedingungen. Molekulare Veränderungen an der RNA-oder Protein-Ebene können dann entschlossen, Mechanismen, die zu neoplastischen Veränderungen aufzuklären.

Während die genaue Ätiologie des Ovarialkarzinoms ist unbekannt, haben eine erhöhte Anzahl von Leben Ovulationen wurde gezeigt, dass mit einem erhöhten Risiko für Eierstockkrebs Cancer ²⁰ korrelieren. In vivo Analyse der Hypothesen verknüpfen Eisprung Eierstockkrebs stellt viele Herausforderungen bei der Bestimmung der Beiträge der Gonadotropine, Proliferation und Entzündungen zur Krebsentstehung ^21-23. Alginat-Hydrogel-Kultur der Eierstöcke und Eileiter ermöglicht Ihnen das isolierte, im direkten Vergleich jeder dieser Komponenten im Eierstock Oberflächenepithel und Eileiter Epithel und führen zu neuen Informationen über die Herkunft von Eierstockkrebs und ihr Fortschreiten von normalen Zellen zu Tumoren.