Inmunofluorescencia ensayo de leptospiras superficie expuesta proteínas

1. La fijación de Leptospira a las diapositivas de cristal

1. Leptospira interrogans es una clase BSL2 patógeno. Trabajar con células vivas que requiere un manejo adecuado, como guantes, bata de laboratorio y medidas de pipeteo en una campana estéril.
2. Crecer Leptospira en EMJH medium11, complementada con suero de conejo al 1% a 30 ° C hasta llegar a mediados o finales de la fase de inicio de sesión (la densidad de 5 x 10 ⁷ 5 x 10 ⁸ células / ml) durante aproximadamente 6 días.
3. La cosecha del cultivo por centrifugación a 2000 xg durante ~ 7 minutos a temperatura ambiente.
4. Eliminar el sobrenadante por aspiración y suavemente resuspender el precipitado en tampón fosfato salino (PBS) -5 mM MgCl _2, pH 7.2 a una concentración final de 5 x 10 ⁸ células / ml.
5. Añadir 1 ml de suspensión celular a cada pocillo de dos y la cámara de diapositivas de vidrio y se incuba a 30 ° C durante 80 minutos para permitir que las células se adhieran.
6. Retire con cuidado el líquido que contiene las células no unidas por la aspiración.
7. Fix restantes bacterias intactas a portaobjetos de vidrio mediante la adición de 1 ml / pocillo de 2% de paraformaldehído en PBS-5 de MgCl ₂ mM. Incubar durante 40 min a 30 ° C. Estas diapositivas serán para la evaluación de la superficie expuesta proteínas.
8. Para evaluar el control de diapositivas bajo la superficie las proteínas, permeabilizar la membrana externa mediante la fijación de 1 ml / pocillo de 100% helado de metanol. Se incuba a 20 ° C durante 20 min. El metanol actúa de varias maneras: permeabilizes la membrana externa, denaturates las proteínas y las células correcciones a las diapositivas de cristal.
9. Eliminar la fijación de los agentes por aspiración.

2. Etiquetado con anticuerpos específicos

1. Bloquear la unión no específica mediante la adición de 1 ml / pocillo de tampón de bloqueo (Difco Leptospira enriquecimiento EMJH). Se incuba a 30 ° C durante 90 min.
2. Diluir el anticuerpo específico (sueros de conejo inmune o los anticuerpos monoclonales de ratón, el suero de conejo aquí policlonales específicos para OmpL54 ^10, FlaA1 ¹² y ¹³ OmpL1) y pre-inmune de conejo líquido ascético sueros o un ratón que no contiene anticuerpos (cuando se utiliza como controles negativos) en tampón de bloqueo. Diluciones para cada anticuerpo tiene que ser determinada empíricamente en función de análisis de anticuerpos, antígeno-anticuerpo reactividad y la abundancia de proteínas en la célula. El rango normal es de 1:50 a 1:600.
3. Retire el amortiguador de bloqueo por aspiración y se añade 1 ml / pocillo de anticuerpos primarios diluidos.
4. Se incuba a 30 ° C durante 1 hora.
5. Eliminar el líquido mediante la aspiración y lavar los pocillos tres veces con PBS (1 ml / pocillo).

3. Visualización de las leptospiras

1. Añadir 1 ml / pocillo de Alexa Fluor 488-anticuerpos secundarios marcados (ya sea de cabra anti-IgG de conejo o cabra anti-ratón IgG) diluido 1:2000 y el ácido nucleico mancha fluorescente, 4'6-diamidino-2-fenil-indol dihidrocloruro ( DAPI) diluido a una concentración final de 0,25 mg / ml en tampón de bloqueo. Este paso asegura la detección de la unión de los anticuerpos y la presencia de todas las espiroquetas independiente de la unión de los anticuerpos, respectivamente.
2. Incubar los portaobjetos a 30 ° C durante 45 min.
3. Eliminar el líquido mediante la aspiración y lavar los pocillos dos veces con PBS y una vez con agua destilada (1 ml / pocillo).
4. Quitar las cámaras y la cinta adhesiva del portaobjetos de vidrio y el aire seco de aproximadamente 10 min.
5. Añadir prolongar Oro anti-fade medio de montaje (2 x 20 l por diapositiva) y un 24 x 50 mm cubierta antideslizante.
6. Incubar toda la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Este paso es necesario para permitir que el medio de montaje para curar (endurecer).
7. Sellar la hoja de la cubierta con esmalte de uñas.
8. Visualizar las manchas por microscopía de fluorescencia utilizando un filtro de detección cian / azul para DAPI y un filtro verde para la detección de Alexa Fluor 488. Para asegurarse de que una representación exacta de las muestras se hace, asegúrese de evaluar el área de la cámara por completo para cada muestra.
9. Registrar los datos de un campo de imágenes representativas de cada muestra. Cuando la imagen Alexa Fluor 488 de fluorescencia, utilice el mismo tiempo de exposición para todas las muestras. El uso de un tiempo de exposición constante permitirá una comparación más precisa de los resultados con los antígenos de prueba frente a los controles.

4. Los resultados representativos:

Ejemplos de los resultados de la superficie de IFA con Leptospira interrogans células utilizando anticuerpos contra la superficie y del subsuelo, las proteínas se muestran en la Figura 2. Una prueba se considera positiva cuando se detecta fluorescencia claramente en las muestras con leptospiras intacto para una proteína de interés que es la superficie expuesta (Figura 2A). Por lo general, un resultado positivo (en este caso, la superficie expuesta OmpL54), la intensidad de fluorescencia aproximadamente el mismo que se observa tanto en las células intactas y permeabilized (Fig. 2A) Es imprescindible incluir un control negativo para la integridad de la membrana externa, el uso de anticuerpos contra un subsuelo , preferiblemente periplasmic proteínas (por ejemplo, la leptospirosis FlaA1, fig. 2B). Sólo cuando los datos muestran que la membrana externa se ha mantenido intacta during el experimento, es decir, anticuerpos contra una proteína de sub-superficie no reaccionan a las células intactas (no fluorescencia o fluorescencia mucho más débil si se compara con la muestra permeabilized como en la fig. 2B), se puede concluir que la proteína (s) de interés superficie expuesta. La inclusión de los experimentos con suero pre-inmune (en el caso de anticuerpos policlonales) como control negativo adicional es esencial para los datos sin ambigüedades y no deben producir fluorescencia claramente en las células intactas o permeabilized (Fig. 2A, 2C). Tinción DAPI es necesario visualizar leptospiras cuando los resultados negativos (no Alexa Fluor 488 fluorescencia) se observan. Contratinción con yoduro de propidio es una alternativa aceptable a la DAPI.

Este método es más cualitativa que cuantitativa, como la fluorescencia más brillante puede ser debida a la superficie expuesta múltiples epítopos antigénicos de ser reconocido en un solo antígeno en relación con otros antígenos de igual abundancia, pero con menos superficie expuesta epítopos. Por lo tanto la intensidad de fluorescencia sólo puede ser utilizado para comparar la reactividad de los mismos anticuerpos, tales como las células intactas frente permeabilized y la intensidad de fluorescencia no entre diferentes proteínas. Esta distinción es importante cuando un resultado ambiguo que se obtiene de fluorescencia mucho menos se observa en las células intactas que en las células permeabilizadas (Fig. 2C). Tal resultado indica que, o bien la proteína está en un lugar debajo de la superficie (con algunas manchas de fondo no específico de las células intactas), los anticuerpos son vinculantes preferentemente a los no nativos epítopos que son expuestos después de la permeabilización de metanol o una proteína puede tener múltiples sitios de localización como se describe para Erp y elp proteínas de otra espiroqueta, Borrelia burgdorferi ^14. En cualquier caso, un resultado ambiguo IFA de este tipo requiere de enfoques alternativos, tales como biotinilación superficie o proteólisis de superficie para determinar si la proteína de interés es la superficie expuesta o no ^10.

Figura 1. Diagrama de flujo para la superficie de ensayo de inmunofluorescencia de Leptospira interrogans espiroquetas. En primer lugar, 1 ml de suspensión celular se añade a cada pocillo de la cámara de diapositivas de dos así (al menos dos láminas para cada experimento) y se incubó durante las leptospiras a que se adhieran. A continuación, las leptospiras se fijan a la cámara de diapositivas mediante la adición de 1 ml / pocillo de 2% de paraformaldehído (PFA) para las muestras con membrana intacta externa (OM) y 1 ml / pocillo de 100% de metanol frío para muestras con permeabilized OM. A continuación, las leptospiras son incubadas con anticuerpos que reconocen proteínas de superficie expuesta, junto con el control de anticuerpos para las proteínas del subsuelo (Primaria AB) a 30 ° C durante 90 min. A continuación, los anticuerpos primarios se detectan mediante la incubación con 1 ml / pocillo de Alexa Fluor 488 anticuerpos secundarios conjugados. Finalmente, las células se visualizan por microscopía de fluorescencia.

Figura 2. Superficie inmunofluorescencia análisis de las proteínas de leptospirosis. Leptospira interrogans espiroquetas se probaron con sueros inmunes y pre-inmune, y los resultados negativos se combina con una contratinción DAPI para demostrar la presencia de espiroquetas. Un filtro verde fluorescencia se utilizan para detectar Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario marcado la unión a las proteínas de la superficie expuesta y azul / cian filtro de fluorescencia para detectar la unión al ADN de células DAPI. A) Las leptospiras probaron con anticuerpos que reconocen una proteína de superficie expuesta, OmpL54 ^10. B) Las células probaron con anticuerpos contra una proteína periplasmic subsuelo, FlaA1 (control negativo). C) Las células probaron con anticuerpos contra la leptospira porina, OmpL1. La unión de suero de conejo a las leptospiras se detectaron con Alexa Fluor 488 conjugado de cabra anti-conejo IgG fragmentos. Todas las imágenes son tomadas después de 4 segundos de exposición largo.

La superficie de nuestra técnica de IFA es similar a la utilizada para demostrar la superficie de exposición de los diversos borrelial ^{15, 16} y leptospirosis ^{12, 17} proteínas. Los detalles de la superficie, método IFA descritos aquí están diseñados para reducir al mínimo la manipulación de células en un esfuerzo por mantener la integridad de la membrana externa de tiempo que se aprovechan de la tendencia de las células de Leptospira a adherirse a las diapositivas de cristal. El método consiste en una concentración más baja (2% frente al 4%) de paraformaldehído, lavado con tampón estabilizadora de membrana externa (PBS 5 mM MgCl ₂₎ y menos pasos de lavado que se había publicado protocolos ^{12, 17.} Además, la superficie de nuestro método de IFA pone de relieve la importancia de los controles que son esenciales para la interpretación de los datos precisos. Una limitación de este método es que requiere de la disponibilidad de anticuerpos específicos que son capaces de reconocer la superficie expuesta al epítopo (s) de la proteína de interés. En algunos casos, el impedimento estérico por otras proteínas de la superficie o lipopolisacáridos pueden prevenir la formación de antígeno-anticuerpo. Sin embargo, el método de la superficie de IFA es una técnica relativamente sencilla para la evaluación directa de exposición de la superficie de las proteínas y puede ser utilizado como un solo enfoque o en combinación con otras técnicas, tales como inmuno-etiquetado, la proteólisis de la superficie, etc