Количественная оценка Белки Использование пептидов обогащению иммуноаффинной В сочетании с масс-спектрометрии

Zhao, L., Whiteaker, J. R., Pope, M. E., Kuhn, E., Jackson, A., Anderson, N. L., et al. Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (53), e2812, doi:10.3791/2812 (2011).

Существует большая потребность в количественных тестов при измерении белков. Традиционные иммунологические сэндвич, в значительной степени считается золотым стандартом в количественной, связаны с высокой стоимостью, долгое время свинца и чреваты недостатки (например, гетерофильных антител, аутоантител помех, "крюк-эффект») ^1. Альтернативная методика является близость обогащения пептидов в сочетании с количественной масс-спектрометрии, как правило, называют SISCAPA (Стабильный Стандарты Изотопные и Capture Анти-пептидов Антитела) ^2. В этой технике, близость обогащение пептиды со стабильной изотопного разбавления и обнаружения по отдельным / множественные реакции мониторинг масс-спектрометрии ( SRM / MRM-MS) обеспечивает количественное измерение пептидов в качестве суррогатов для соответствующих белков. SRM / MRM-МС хорошо установлена ​​для точного количественного определения малых молекул, ^{3, 4} и совсем недавно был адаптирован для измерения концентрации белков в плазме крови и клеточных лизатов. ^5-7 Для достижения количественного определения белков, эти крупные молекулы перевариваются до Компонент пептидов использованием ферментов, таких как трипсин. Один или несколько выбранных пептиды, последовательность является уникальным для целевого белка в том, что виды (например, "proteotypic" пептидов) затем обогащенный из примера с использованием анти-пептидных антител и измеряется как количественными суррогаты для стехиометрической концентрации белка в образце. Таким образом, в сочетании с стабильным изотопного разбавления (SID) методов (например, шипами в стабильный изотоп меченый пептид стандарт), SRM / MRM может быть использован для измерения концентрации proteotypic пептидов в качестве суррогатов для количественного определения белков в сложных биологических матриц. Методы имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными иммуноанализа. Реагенты сравнительно дешевле генерировать, специфичность для аналита отлично, анализы могут быть очень мультиплексированных, обогащение может быть выполнена с аккуратным плазмы (без истощения требуется), и техника поддается широкий спектр белков или модификации интересов. ^8-13 В этом видео мы демонстрируем основной протокол, как адаптировать к магнитной бусины платформы.

Экспериментальные процедуры:

Анализ требует синтетические пептиды и анти-пептидных антител. Выбранный пептиды должны быть уникальными для белок, содержат от 8 до 22 аминокислот, и не известно пост-трансляционной модификации. Метионин остатков, как правило, избегали и пептиды, содержащие двухосновных аминокислот (например, KK, KR, РР) нежелательны. Для реализации этой технологии, она является общей для использования стабильных изотопов в качестве меченых пептидов внутренние стандарты, включая тяжелые ⁽¹³ С и ¹⁵ N) меченых аминокислот на С-конце пептида (т.е. К или R помечены).

Следующий протокол описывает анализа разработана для измерения пептид GDSLAYGLR от Остеопонтин белка мыши, используя анти-пептидных антител, полученных от Epitomics Inc (Burlingame, CA) и синтетических пептидов из Новой Англии пептида (Гарднер, М. А.). Протокол состоит из трех основных этапов (рис. 1): 1) Трипсин переваривания сложную смесь белков, 2) Обогащение пептиды 3) Анализ масс-спектрометрии. Он будет продемонстрирован на человека образце плазмы с шипами белка остеопонтина мыши.

1. Трипсин ферментативного пищеварения и очистки

1. Оттепель 10 мкл аккуратные аликвоты плазмы на льду.
2. Определение общей концентрации белка с помощью анализа ДСС и центрифуги образец для удаления взвешенных твердых частиц.
3. Внесите 10 мкл от его хранения трубки 1000 мкл пластины Дипуэлл и накрыть Pierce-в состоянии фильма.
4. Добавьте 20 мкл свежей 9 месяцев мочевины / 30mm дитиотреитол (DTT) (конечная концентрация 6М мочевины / 20 мМ DTT) для каждого образца.
5. Инкубировать 30 минут при 37 ° C.
6. Добавить 3 мкл свежей 500 мМ iodoacetamide (окончательный IAM 50 мм) для каждого образца.
7. Инкубируйте в течение 30 минут в темном месте при комнатной температуре.
8. Добавить 257 мкл 100 мМ трис (рН 8) (разбавляет мочевины до ~ 0,6 М).
9. Добавьте 10 мкл исходного раствора трипсина (1 мкг / мкл, для 1:50 фермент: субстрат отношение).
10. Инкубируйте 37 ° С в течение ночи (12-16 часов).
11. Добавить 3 мкл аккуратные муравьиной кислоты (конечной концентрации 1%).
12. Добавить стабильный изотоп стандартных (множественные стандарты добавляется, если выполнение мультиплексный анализ, как правило, это около 10 мкл содержащего 50-100 фмоль стандартной изотопно меченного пептида).
13. Промыть пластины Oasis картридж хорошо с 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитрила, отбрасывая проточные. Повторите это 3 раза.
14. Равновесия картридж пластины, добавив 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде, и отбросить проточные. Повторите 4 раза.
15. Нагрузка переварить образцы пластину картриджа и регулировать вакуум таким потоком идет очень медленно.
16. Промыть 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде, и отбросить проточные. Повторите это 3 раза.
17. Элюции пептидов, добавив 2 х 500 мкл 0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитрила в 1000 мкл глубоких скважин пластины (не выбрасывайте проточные).
18. Lyophilize (или speedvac) элюата досуха. (Лиофилизации является предпочтительным методом)
19. Развести сухой пептидов добавлением 50 мкл PBS + 0,03% CHAPS.

2. Пептид иммуноаффинной обогащения

1. Передача образца стандартных Kingfisher 96-луночных.
2. Добавьте 1 мкг антител и 1,5 мкл белка-G покрытием магнитных гранул в год (это не является обязательным для сшивания антитела к бисера перед добавлением). Обеспечить бисер хорошо подвешен при встряхивании или вортексе.
3. Обложка пластинки с пленкой.
4. Инкубируйте ночь (12-16 часа) с нежным акробатика для обеспечения бисер приостановлено.
5. Центрифуга пластины на 32 мкг в течение 5 секунд, чтобы удалить жидкость из поверхности фольги.
6. Удалить фольгу крышку.
7. Стиральные и элюирование бусины могут быть выполнены вручную или в автоматическом режиме. Эта процедура описывает шаги автоматизированы на Kingfisher платформы.
8. Вымойте бисером 2 раза с 200 мкл PBS + 0,03% CHAPS (1 минута за мытье).
9. Вымойте бисером 1 раз в 200 мкл 1:10 разбавление PBS + 0,03% CHAPS (1 минута).
10. Пептиды элюировали в 25 мкл 5% уксусной кислоты + 0,03% CHAPS.
11. Место элюирования пластину на магнит и передачи элюата в 96 ячейках, заботясь не передавать остатки бус.
12. Обложка пластинки с уплотнением мат.
13. Пластины, содержащей элюата доставляется тройной quadrapole масс-спектрометр для анализа.

3. Анализ по нескольким мониторинга реакции - масс-спектрометрии

1. Переходы для SRM / MRM анализа могут быть выбраны и оптимизированы вливая 1 picomole на микролитр решение пептид стандарт в 30% acetonitrile/0.1% муравьиной кислоты в масс-спектрометр на 0,5 мкл / мин. После стабильного распыления получается, собирать MS / MS спектра.
2. Переходы выбираются из MS / MS спектр путем выявления Автошоуэлектронной обильные ионов фрагмента в области спектра с небольшим шумом. Для многозарядных ионов пептид, у-ионные фрагменты обнаружены на т / г> предшественником т / г, как правило, лучше всего для SRM / MRM анализа развития. Рисунок 2 показывает, MS / MS спектр и отдельных ионов переходных 476,3> 508,3, 579,3 , 692,4 (переходы для тяжелого стабильного изотопа стандартных 481,3> 518,3, 589,3, 702,4 не показан) для пептида GDSLAYGLR.
3. В зависимости от марки и модели использован масс-спектрометр, Есть несколько параметров, которые могут быть оптимизированы для каждого перехода. Здесь, мы оптимизировали столкновения энергия каждого выбранного перехода наращивает энергию столкновения и мониторинга уровня сигнала. Энергии столкновения в 25 был использован для каждого перехода.
4. Одним словом, типичная конфигурация для SRM / MRM анализа выглядит следующим образом: Подвижная фаза () 0,1% муравьиной кислоты; (б) 90% ацетонитрил / 0,1% муравьиной кислоты, 0,3 х 5 мм C18 колонка ловушка, 75 мкм ID х 15 см C18 аналитическую колонку (Reprosil-Пур C18 AQ, 120 A ° поры). Инъекции объемом 10 мкл и образец загружается в течение 5 минут при 3% B на общую скорость потока 3 мкл / мин и элюировали линейным градиентом от 3 - 45% В при 300 - 400 Нл / мин в течение 10 мин. Условия на 4000 QTRAP (ABSCIEX, Foster City, CA) были брызги напряжения 2.3kV, ионная температура источника 150 ° С, GS1 12, и занавес газа 15.
5. Образец проанализирован SRM / MRM путем введения 10 мкл образца. Пик областях интегрированы для легких и тяжелых пептидов с помощью программы Skyline. ¹⁴ Рассчитать пик соотношение площади (PAR) немеченого / меченого пептида в каждом примера с использованием наиболее распространенных перехода, который свободен от фонового шума, в данном случае, переход y5 (светло пептид 476,3> 579,3, тяжелые стандартных пептидных 481,3> 589,3).

4. Представитель Результаты:

Измеренные пик соотношения площади (свет эндогенных относительной пептид шипами тяжелых изотопно меченного пептида) обеспечивают количественную меру целевой пептид. Рисунок 3 показывает пример хроматограммы легких и тяжелых пептидов в SISCAPA обогащенного образца. Обратите внимание, что легкие и тяжелые пептидов элюируются в то же время и многочисленные переходы можно отслеживать для каждого пептида для подтверждения личности.

Рисунок 1. Схематический обзор процесса SISCAPA. Сложная смесь белка усваивается на пептиды. Целевые пептидных аналитов (эндогенные аналита и шипами стабильного изотопа меченных внутренний стандарт) обогащены с использованием анти-пептидных антител иммобилизованных на Protein G-покрытием магнитных частиц. После изоляции, целевые пептиды элюируют из магнитных частиц и проанализированы масс-спектрометрии для количественного относительно внутреннего стандарта.

Рисунок 2. MS / MS спектр пептидных GDSLAYGLR показывает выбор из трех фрагментов для SRM / MRM переходами.

Рисунок 3. Пример хроматограммы показывает пик профиля свет анализируемого пептида (красный) и тяжелый стабильный изотоп меченных внутреннего стандарта (синий). Хроматограммы для y5 переход от света пептид (476,3> 579,3) и тяжелого стабильного изотопа помечены стандарт (481,3> 589,3) нанесены в течение долгого времени, как они элюируются из хроматографии системы.

Наиболее важным шагом в протокол, как описано, является обеспечение бисером остаются хорошо перемешанных в течение инкубационного периода. Разрешение бисером осели на дно колодца / флакон приведет к увеличению изменчивости. Важно также, чтобы спин-вниз любой жидкости, которые могут остаться на вершине и / флакон следующие инкубационного периода. Воспроизводимые пищеварения трипсина также имеет важное значение. Процедуры для пищеварения, описанные здесь был использован широко в нашей лаборатории совместно с SISCAPA, однако, вполне вероятно, альтернативные методы пищеварения может быть оптимизирована для данного набора белков-мишеней ¹⁵ Элюирование свободных антител не мешает обнаружению. пептид, вероятно, потому что антитела, исключается из столбца или элюируется позднее пептидов, но антитела могут быть сшиты с гранулами Protein G до близости обогащения в крупных экспериментов или при наличии свободных антител становится проблемой. Кроме того, мы сочли целесообразным поместить магнит ниже образец пластина на автосамплером а также стирку ловушку колонки в обратном направлении потока (по сравнению с загрузкой), чтобы удалить остатки бисера или частиц. В дополнение к магнитной бусины подход, описанный, метод также может быть адаптирована к колонке формате (т.е. аффинная хроматография). ^{12, 16}

После того как пользователь комфортно с общим протоколом, техника также поддаются несколько модификаций, которые повышают общий анализ. ^{11-первых,} это возможность анализировать несколько аналитов в одном анализе, комбинируя антитела в обогащении шаг (т.е. мультиплексирование). Масс-спектрометр, способный одновременно анализировать большое количество аналитов. Во-вторых, увеличение объема исходного образца повышает чувствительность анализа.

Нет конфликта интересов объявлены.

Эта работа финансировалась NCI Клинические протеомных технологии Assessment Center (CPTAC) гранта (# U24 CA126476), а также грант от индустрии развлечений Foundation (РКРП) и Cancer Research EIF Женский фонд для биомаркеров груди Консорциум Discovery Рака, и щедрые подарки от фонда Кека, Канарские Фонда и Пол Г. Аллен Фонд семьи.

1. Hoofnagle, A.N. & Wener, M.H. The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry. J. Immunol. Methods 347, 3-11 (2009).
2. Anderson, N.L., et al. Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA). J Proteome Res 3, 235-44 (2004).
3. Chace, D.H. & Kalas, T.A. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clin Biochem 38, 296-309 (2005).
4. Want, E.J., Cravatt, B.F. & Siuzdak, G. The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization. Chembiochem 6, 1941-51 (2005).
5. Barr, J.R., et al. Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I. Clin Chem 42, 1676-82 (1996).
6. Gerber, S.A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M.W. & Gygi, S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6940-5 (2003).
7. Kuhn, E., et al. Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards. Proteomics 4, 1175-86 (2004).
8. Whiteaker, J.R., et al. Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers. Anal Biochem 362, 44-54 (2007).
9. Hoofnagle, A.N., Becker, J.O., Wener, M.H. & Heinecke, J.W. Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry. Clin Chem 54 , 1796-804 (2008).
10. Kuhn, E., et al. Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry. Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).
11. Whiteaker, J.R., Zhao, L., Anderson, L. & Paulovich, A.G. An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers. Mol. Cell. Proteomics 9, 184-196 (2010).
12. Neubert, H., Gale, J. & Muirhead, D. Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen. Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).
13. Ackermann, B.L. & Berna, M.J. Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers. Expert Rev. Proteomics 4, 175-186 (2007).
14. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics 26, 966-968 (2010).
15. Proc, J.L., et al. A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin. J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).
16. Berna, M., et al. Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation. Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).

1 Comment

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.