Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Russian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

1, 1, 1,2

1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 72.44.48.122, User IP: 72.44.48.122, User IP Hex: 1210855546

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (53), e2813, doi:10.3791/2813 (2011).

Discussion: Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

Ряд методов были использованы ранее дифференцировать эритроидных клеток в культуре с переменным успехом. Например, некоторые протоколы без со-культуры на MS-5 позволяет расширение эритроидных клеток, но не эффективным в производстве полностью зрелых безъядерных эритроцитов 12-17. Хотя другие методы позволяют эффективно энуклеации, это за счет распространения 18,19. Метод, который мы использовали здесь, первоначально разработанный Дуэ лаборатории 6, сочетает в исходной жидкости шаг культуры, которая продлевает ячейки усиления на ранних стадиях дифференциации эритроидных и, следовательно, дает нам большое количество ранних предшественников (необходимых для геномики и протеомики исследований) , и второй этап совместного культуры на MS-5 мезенхимальные клетки, что очень важно, чтобы максимизировать синтеза гемоглобина и получить полную энуклеации красных кровяных телец. Два ограничения нашего метода являются: 1) по-прежнему недостаточной степени усиления на ранних стадиях дифференцировки, которая пока не позволяет нам в полной мере характеризуют очень ранних эритроидных предшественников на уровне белка и 2) высокие затраты на выполнение этого протокола, Особенно в крупных масштабах.

Качество культуре клеток и цитокинов реагентов имеет важное значение для бывших дифференциации естественных эритроидных. Следует отметить, что использование BIT (табл. 2) в качестве замены сыворотки имеет решающее значение. Действительно, в нашем опыте использования БИТ устранены от партии к партии изменения, которые мы испытывали ранее (вероятно, из-за различий в чистоте реагентов) при использовании отдельных источников Бычий сывороточный альбумин, инсулин и трансферрина. Другим важным моментом является качество MS-5 слой используется для совместного культуры эритроидных клеток. В самом деле, MS-5 клетки должны быть 70%, когда сливной эритроидных клетках добавляются и необходимо менять каждые 3-4 дней. Если MS-5 клетками слишком сливающийся, эритроидных клеток, не будет расти и дифференцироваться должным образом. Кроме того, нездоровая MS-5 клеток, как правило, отделить, делая уборку эритроидных клеток трудно.

Предыдущие методы использовали ретровирус для генной доставки в гемопоэтических стволовых / прогениторных клеток в культуре. Тем не менее, ретровирусы заражают только делящиеся клетки, и поэтому не эффективны в основном заражение покоя CD34 + клетки, выделенные из пуповинной крови, костного мозга или лейкафереза ​​20. Главное преимущество лентивирусов подходов к генной доставки, что позволяет эффективно заражения клеток независимо от их распространения статуса 7,21. Наши лентивирусов-опосредованной доставки генов позволяет эффективно нокдаун или по-экспресс специфические факторы транскрипции, которые могут изменить судьбу ячейки. Соответствующие фенотипический анализ (клеточных и молекулярных) может быть разработан после заражения выявить особенности фенотипов. Кроме того, рост условия могут быть изменены в пользу частности клеточных типов после заражения. По этим линиям, в этом протоколе мы решили не использовать любые методы, чтобы выбрать лентивирус-инфицированные клетки по двум основным причинам: 1) наши инфекции эффективность очень высока (рис. 6С) и 2), мы обеспокоены тем, что методы, используемые для выбора лентивирус-инфицированные клетки (например, клеточной сортировки или антибиотик) смещены в сторону выживания / пролиферирующие клетки, которые способны выражать либо антибиотикам ген устойчивости или флуоресцентного маркера на высоком уровне тем самым скрывая потенциальных апоптоза фенотипа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements: Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

Мы благодарим Л. Дуэ и МС Giarratana (Université Paris VI, Франция) за консультацией по бывшей естественных условиях дифференциации эритроидных, Д. Аллан и Х. Аткинс (Огржи, Канада) за предоставление образцов крови (полученные в Оттаве больницы по этике исследований Совет # 2007804-01H), Д. Trono (Ecole Polytechnique Federale Лозанны) для обеспечения лентивирусов векторов и FJ Дилворт (Огржи, Канада) для критически чтении рукописи. Этот проект был профинансирован CIHR гранта (СС-82813), чтобы MBCGP является получателем фонд Ontario вычислительный Обучение Regulomics Докторантура стипендий. МБ заведует кафедрой Канаде исследований в регуляции экспрессии генов.

References: Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

  1. Orkin, S.H. & Zon, L.I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell 132, 631-644 (2008).
  2. Kim, S.I. & Bresnick, E.H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene 26 (2007).
  3. Friend, C., Patuleia, M.C. & De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr 22, 505-522 (1966).
  4. Weiss, M.J., Yu, C. & Orkin, S.H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol 17, 1642-1651 (1997).
  5. Lozzio, B.B., Lozzio, C.B., Bamberger, E.G. & Feliu, A.S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med 166, 546-550 (1981).
  6. Giarratana, M.C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol 23, 69-74 (2005).
  7. Salmon, P. & Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci Chapter 4, Unit 4 21 (2006).
  8. Chao, M.P., Seita, J. & Weissman, I.L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 73, 439-449 (2008).
  9. Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F. & Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther 6, 673-677 (2002).
  10. Laurenti, E., et al. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells 28, 1390-1398 (2010).
  11. Palii, C.G., et al. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J 30, 494-509 (2011).
  12. Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A. & Rachmilewitz, E.A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood 73, 100-103 (1989).
  13. Wada, H., et al. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood 75, 505-511 (1990).
  14. Sui, X., et al. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med 183, 837-845 (1996).
  15. Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M.Y. & Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood 92, 3658-3668 (1998).
  16. von Lindern, M., et al. The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood 94, 550-559 (1999).
  17. Freyssinier, J.M., et al. Purification, amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol 106, 912-922 (1999).
  18. Malik, P., et al. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood 91, 2664-2671 (1998).
  19. Carlile, G.W., Smith, D.H. & Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood 103, 4310-4316 (2004).
  20. Mazurier, F., et al. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther 5, 556-562 (1998).
  21. Salmon, P., et al. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood 96, 3392-3398 (2000).

Ask the Author: Лентивирусов-опосредованной Нокдаун В Ex Vivo Эритропоэз прав гемопоэтических стволовых клеток

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter