Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE General

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

1, 1, 1,2

1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 50.16.166.175, User IP: 50.16.166.175, User IP Hex: 839952047

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (53), e2813, doi:10.3791/2813 (2011).

Abstract: Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis היא מערכת מודל נפוץ ללמוד התמיינות תאים. במהלך erythropoiesis, pluripotent אדם מבוגר hematopoietic בתאי גזע (HSCs) להתמיין אבות oligopotent, מבשרי מחויב ובוגרת כדוריות דם אדומות 1. תהליך זה מווסת על חלק גדול ברמה של ביטוי גנים, לפיו גורמי שעתוק ספציפיים להפעיל השושלת גנים ספציפיים במקביל תוך הדחקת גנים ספציפיים סוגי תאים אחרים 2. מחקרים על גורמי תעתוק ויסות erythropoiesis מבוצעות בדרך כלל באמצעות שורות תאים אנושיים המייצגות Murine, במידה מסוימת, תאים erythroid בשלבים נתון של בידול 3-5. שורות תאים יכולים להפוך זאת באופן חלקי בלבד לחקות תאים erythroid והכי חשוב הם לא מאפשרים אחד comprehensibly המחקר שינויים דינמיים המתרחשים התקדמות תאים בשלבים רבים לקראת גורלו הסופי erythroid שלהם. לכן, האתגר הנוכחי נותר פיתוח פרוטוקול להשיג אוכלוסיות הומוגניות יחסית של HSCs הראשי erythroid תאים בשלבים שונים של התמיינות בכמויות מספיקות כדי לבצע גנומיקה ניסויים proteomics.

כאן אנו מתארים vivo לשעבר לתא תרבות פרוטוקול להשרות התמיינות erythroid מן האדם גזע / ובתאים hematopoietic שהיו מבודדים מהדם או טבורי, מח עצם או דם היקפי מבוגר מגויסת עם G-CSF (leukapheresis). מערכת זו תרבות, שפותחה לראשונה על ידי המעבדה Douay 6, משתמשת ציטוקינים ושיתוף תרבות על תאים mesenchymal לחקות את microenvironment מח עצם. שימוש בפרוטוקול לשעבר בידול vivo, אנו צופים הגברה חזקה של אבות erythroid, אינדוקציה של דיפרנציאציה אך ורק כלפי השושלת erythroid ו התבגרות להשלים לשלב enucleated כדוריות דם אדומות. לכן, מערכת זו מספקת הזדמנות ללמוד את המנגנון המולקולרי של ויסות תעתיק התקדמות בתאי גזע hematopoietic לאורך השושלת erythroid.

לימוד erythropoiesis ברמה תעתיק גם דורש את היכולת גורמים ספציפיים מעל מפורשת או מציאה ב העיקרי תאים erythroid. לשם כך, אנו משתמשים lentivirus בתיווך משלוח גן מערכת המאפשרת זיהום יעיל של שניהם חלוקת ולא חלוקת תאים 7. כאן אנו מראים כי אנו מסוגלים ביעילות מציאה גורם שעתוק בתוך TAL1 העיקרי erythroid תאים אנושיים. בנוסף, ביטוי של GFP מדגים יעילות של זיהום lentiviral קרוב ל 90%. לפיכך, פרוטוקול שלנו מספק מערכת שימושית מאוד עבור אפיון של רשת רגולטורית של גורמי תעתוק כי erythropoiesis שליטה.

Discussion: Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

מספר שיטות שימשו בעבר להבדיל תאים erythroid בתרבות עם דרגות משתנות של הצלחה. לדוגמה, כמה פרוטוקולים ללא תרבות משותפת על MS-5 מאפשרת הרחבה של תאים erythroid אך אינם יעילים בהפקת לבגרות מלאה בתאי דם אדומים enucleated 12-17. בעוד שיטות אחרות לאפשר enucleation יעיל, זה על חשבונם של התפשטות 18,19. השיטה השתמשנו כאן, שפותחה לראשונה על ידי המעבדה Douay 6, המשלבת צעד ראשון תרבות נוזלי, אשר מאריך הגברה התא במהלך השלבים המוקדמים של בידול erythroid ובכך מספק לנו מספר גדול של אבות מוקדם (הכרחי הגנומיקה ומחקרים proteomics) , ואת השלב השני של תרבות משותפת על MS-5 תאים mesenchymal, וזה חשוב על מנת למקסם את סינתזת המוגלובין להשיג enucleation מלאה של כדוריות דם אדומות. שתי מגבלות השיטה שלנו הם 1) את מידת מספיק עדיין הגברה בשלבים המוקדמים של בידול, שעד כה מנעה מאיתנו מלא לאפיין את אבות מוקדם מאוד erythroid ברמת חלבון 2) את העלות הגבוהה של ביצוע הפרוטוקול, במיוחד בקנה מידה גדול.

איכות תרבות ריאגנטים התא ציטוקינים חיונית ההבחנה לשעבר erythroid vivo. יש לציין כי השימוש BIT (טבלה 2) כתחליף בסרום היא קריטית. ואכן בחוויה שלנו את השימוש BIT בוטלו אצווה ל-אצווה וריאציות שחווינו בעבר (סביר בשל ההבדלים טוהר מגיב) כאשר באמצעות מקורות נפרדים של שור אינסולין בדם, אלבומין ו transferrin. עוד נקודה קריטית היא איכות שכבת MS-5 המשמש תרבות משותפת של תאים erythroid. ואכן, MS-5 תאים יש ומחוברות 70% כאשר תאים erythroid מתווספים יש לשנות את כל 3-4 ימים. אם MS-5 תאים ומחוברות יותר מדי, התאים erythroid לא יגדל להבחין כראוי. בנוסף, לא בריא MS-5 תאים נוטים לנתק, מה שהופך את קצירת התאים erythroid קשה.

שיטות הקודם השתמשו רטרווירוס למסירה, גנים גזע / ובתאים hematopoietic בתרבות. עם זאת, רטרווירוסים להדביק רק תאים מתחלקים ולכן אינם יעילים הדבקה של שקט בעיקר CD34 + תאים מבודדים דם טבורי, מח עצם או leukapheresis 20. היתרון העיקרי של גישות lentiviral עבור משלוח של גן הוא שהיא מאפשרת זיהום יעילה של תאים באופן עצמאי מעמד התרבות שלהם 7,21. משלוח lentiviral בתיווך שלנו הגן מאפשר מציאה ביעילות או יתר להביע גורמי שעתוק ספציפיים שיכולים לשנות את גורל התא. מנתח פנוטיפי המתאים (תאית ומולקולרית) יכול להיות המציאו לאחר ההדבקה לחשוף פנוטיפים בפרט. בנוסף, תנאי הגידול עשויים להשתנות לטובת מסוים התא סוגי לאחר ההדבקה. ברוח דברים אלה, בפרוטוקול זה בחרנו לא להשתמש בכל שיטה כדי לבחור lentivirus תאים הנגועים משתי סיבות עיקריות: 1) יעילות ההדבקה שלנו הוא גבוה מאוד (איור 6C) ו 2) אנו חוששים כי האמצעים שננקטו כדי לבחור lentivirus תאים הנגועים (למשל תאים מיון או אנטיביוטיקה) מוטים כלפי לשרוד / מתרבים התאים מסוגלים לבטא את הגן או עמידות לאנטיביוטיקה או את הסמן פלורסנט ברמות גבוהות ובכך מסתיר פנוטיפ אפופטוטיים פוטנציאליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements: Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

אנו מודים ל Douay ו MC Giarratana (אוניברסיטת פריס VI, צרפת) עצה על בידול vivo erythroid לשעבר, אלן ד 'וה' אטקינס (OHRI, קנדה) למתן דגימות דם (שהושג לפי מחקר החולים אוטווה אתיקה עמוד # 2007804-01H), ד Trono (אקול פוליטכניק הפדרלי דה לוזאן) עבור מתן וקטורים lentiviral ו FJ דילוורת' (OHRI, קנדה) עבור אנושות לקרוא את כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי מענק CIHR (MOP-82813) כדי MBCGP הוא מקבל מלגת קרן מחקר אונטריו הדרכה Regulomics חישובית דוקטורים. MB הקתדרה למחקר בקנדה בתקנה של ביטוי גנים.

References: Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

  1. Orkin, S.H. & Zon, L.I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell 132, 631-644 (2008).
  2. Kim, S.I. & Bresnick, E.H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene 26 (2007).
  3. Friend, C., Patuleia, M.C. & De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr 22, 505-522 (1966).
  4. Weiss, M.J., Yu, C. & Orkin, S.H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol 17, 1642-1651 (1997).
  5. Lozzio, B.B., Lozzio, C.B., Bamberger, E.G. & Feliu, A.S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med 166, 546-550 (1981).
  6. Giarratana, M.C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol 23, 69-74 (2005).
  7. Salmon, P. & Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci Chapter 4, Unit 4 21 (2006).
  8. Chao, M.P., Seita, J. & Weissman, I.L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 73, 439-449 (2008).
  9. Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F. & Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther 6, 673-677 (2002).
  10. Laurenti, E., et al. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells 28, 1390-1398 (2010).
  11. Palii, C.G., et al. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J 30, 494-509 (2011).
  12. Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A. & Rachmilewitz, E.A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood 73, 100-103 (1989).
  13. Wada, H., et al. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood 75, 505-511 (1990).
  14. Sui, X., et al. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med 183, 837-845 (1996).
  15. Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M.Y. & Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood 92, 3658-3668 (1998).
  16. von Lindern, M., et al. The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood 94, 550-559 (1999).
  17. Freyssinier, J.M., et al. Purification, amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol 106, 912-922 (1999).
  18. Malik, P., et al. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood 91, 2664-2671 (1998).
  19. Carlile, G.W., Smith, D.H. & Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood 103, 4310-4316 (2004).
  20. Mazurier, F., et al. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther 5, 556-562 (1998).
  21. Salmon, P., et al. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood 96, 3392-3398 (2000).

Ask the Author: Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter