The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa
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Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (53), e2813, doi:10.3791/2813 (2011).
La eritropoyesis es un sistema modelo utilizado para estudiar la diferenciación celular. Durante la eritropoyesis, pluripotentes humanas adultas células madre hematopoyéticas (HSC) se diferencian en células progenitoras oligopotent, precursores comprometidos y los glóbulos rojos maduros 1. Este proceso está regulado en gran parte a nivel de la expresión génica, en el que factores de transcripción específicos del linaje activar genes específicos, mientras que simultáneamente la represión de los genes que son específicos para otros tipos de células 2. Los estudios sobre factores de transcripción que regula la eritropoyesis se realizan a menudo con líneas celulares humanas y murinas que representan, en cierta medida, las células eritroides en las etapas de diferenciación dado 5.3. Sin embargo, líneas de células transformadas pueden imitar sólo parcialmente las células eritroides y lo más importante no permitir que un estudio de forma comprensible los cambios dinámicos que ocurren cuando las células de los avances a través de muchas etapas hacia su último destino eritroides. Por lo tanto, un reto actual sigue siendo el desarrollo de un protocolo para obtener una población relativamente homogénea de las CMH primario y las células eritroides en las diversas etapas de diferenciación en cantidades que sean suficientes para llevar a cabo la genómica y la proteómica experimentos.
A continuación se describe una célula de ex vivo protocolo de cultivo para inducir la diferenciación eritroide de hematopoyéticas humanas células madre / progenitoras que han sido aislados de sangre del cordón umbilical o de médula ósea o sangre periférica movilizada para adultos con G-CSF (aféresis). Este sistema de cultivo, inicialmente desarrollado por el laboratorio de Douay 6, utiliza las citocinas y la cultura co-en las células mesenquimales para imitar el microambiente de la médula ósea. El uso de este protocolo de diferenciación in vivo ex, se observa una fuerte amplificación de los progenitores eritroides, la inducción de diferenciación exclusivamente hacia el linaje eritroide y una maduración completa a la etapa de enucleado los glóbulos rojos. Así, este sistema ofrece la oportunidad de estudiar el mecanismo molecular de la regulación transcripcional de las células madre hematopoyéticas progreso a lo largo del linaje eritroide.
El estudio de la eritropoyesis en el nivel de la transcripción también se requiere la capacidad de los factores específicos de más de expresar o una caída en la enseñanza primaria las células eritroides. Para ello, se utiliza un sistema de genes lentivirus mediada por la entrega que permite que la infección eficiente de la división y que no se dividen las células 7. Aquí mostramos que somos capaces de caída de manera eficiente la TAL1 factor de transcripción en células primarias de eritroides humanos. Además, la expresión de GFP demuestra una eficiencia de la infección por lentivirus cerca del 90%. Por lo tanto, el protocolo ofrece un sistema muy útil para la caracterización de la red de regulación de factores de transcripción que la eritropoyesis control.
Una serie de métodos se han utilizado previamente para diferenciar las células eritroides en la cultura, con grados variables de éxito. Por ejemplo, algunos protocolos, sin co-cultivo de MS-5 permite la expansión de las células eritroides, pero no son eficientes en la producción de células completamente maduros enucleados rojos 12-17. Mientras que otros métodos permiten la enucleación eficiente, es a expensas de la proliferación de 18,19. El método que hemos utilizado aquí, inicialmente desarrollado por el laboratorio de Douay 6, combina un paso inicial de cultivo líquido, lo que prolonga la amplificación de células durante las primeras etapas de diferenciación eritroide y por lo tanto nos proporciona un gran número de primeros progenitores (necesario para la genómica y la proteómica estudios) , y una segunda etapa de co-cultivo de MS-5 células mesenquimales, que es importante para maximizar la síntesis de hemoglobina y para obtener la enucleación completa de los glóbulos rojos. Dos limitaciones de este método son: 1) el insuficiente grado de amplificación en las primeras etapas de diferenciación, que hasta ahora nos ha impedido para caracterizar completamente los progenitores eritroides muy temprano en el nivel de proteína y 2) el alto costo de llevar a cabo este protocolo, sobre todo en una gran escala.
La calidad de los reactivos de cultivo de células y citoquinas es esencial para la ex vivo diferenciación eritroide. En particular, el uso de la BIT (Tabla 2) como un sustituto de suero es fundamental. De hecho, en nuestra experiencia el uso de la BIT eliminado de lote a lote de las variaciones que hemos experimentado con anterioridad (probablemente debido a diferencias en la pureza de reactivo) cuando se utilizan fuentes distintas de la bovina de insulina en suero albúmina y transferrina. Otro punto crítico es la calidad de la capa de MS-5 utilizado para co-cultivo de células eritroides. De hecho, MS-5 células debe ser del 70% confluentes, cuando las células eritroides se agregan y se debe cambiar cada 3-4 días. Si MS-5 células son muy confluentes, las células eritroides no va a crecer y diferenciar correctamente. Además, insalubres MS-5 células tienden a separar, por lo que la recolección de células eritroides difícil.
Los métodos anteriores han utilizado retrovirus para el gen de la entrega de hematopoyéticas células madre / progenitoras de la cultura. Sin embargo, los retrovirus infectan sólo las células en división y por lo tanto no es eficiente en infectar el reposo, principalmente las células CD34 + aisladas de sangre de cordón umbilical, médula ósea o aféresis 20. La principal ventaja de los enfoques lentiviral para el gen de la entrega es que permite una eficiente infección de las células, independientemente de su estado de proliferación de 7,21. Nuestra lentiviral mediada por la entrega de genes permite de manera eficiente caída o sobre-expresan factores de transcripción específicos que pueden modificar el destino celular. Apropiado análisis fenotípico (celulares y moleculares) se pueden concebir después de la infección para revelar fenotipos particulares. Además, las condiciones de crecimiento puede ser alterado para favorecer a determinado tipos de células después de la infección. En este sentido, en este protocolo, se ha optado por no utilizar ningún método de selección de lentivirus de las células infectadas por dos razones principales: 1) nuestra eficacia la infección es muy alta (Figura 6) y 2) nos preocupa que los métodos utilizados para seleccionar lentivirus de las células infectadas (por ejemplo, células de clasificación o antibióticos) están orientados a los sobrevivientes / proliferación de las células que son capaces de expresar tanto el gen de resistencia a antibióticos o el marcador fluorescente en los altos niveles ocultando así un fenotipo apoptótico potencial.
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No hay conflictos de interés declarado.
Agradecemos a L. Douay y MC Giarratana (Universidad de París VI, Francia) para el asesoramiento en la diferenciación eritroide ex vivo, D. Allan H. y Atkins (OHRI, Canadá) para proporcionar muestras de sangre (obtenida en el Hospital de Ottawa de Ética de Investigación de la Junta # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) para proporcionar a los vectores lentiviral y FJ Dilworth (OHRI, Canadá) para la lectura crítica del manuscrito. Este proyecto fue financiado por una subvención CIHR (MOP-82813) para MBCGP es un beneficiario de una investigación Ontario Fondo Computacional Becas de Formación Postdoctoral Regulomics. MB titular de la Cátedra de Investigación de Canadá en el Reglamento de la expresión génica.
