The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa
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Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells. J. Vis. Exp. (53), e2813, doi:10.3791/2813 (2011).
तरीकों की एक संख्या पहले से इस्तेमाल किया गया है संस्कृति में सफलता की चर डिग्री के साथ erythroid कोशिकाओं को अलग. उदाहरण के लिए, MS-5 पर सह संस्कृति के बिना कुछ प्रोटोकॉल erythroid कोशिकाओं के विस्तार की अनुमति देता है, लेकिन पूरी तरह से परिपक्व enucleated लाल रक्त कोशिकाओं 12-17 उत्पादन में कुशल नहीं हैं. जबकि अन्य तरीकों कुशल enucleation की अनुमति है, यह 18,19 प्रसार की कीमत पर है. विधि हम यहां इस्तेमाल किया है, शुरू में Douay 6 प्रयोगशाला द्वारा विकसित, एक प्रारंभिक तरल संस्कृति कदम है, जो erythroid भेदभाव के प्रारंभिक दौर के दौरान सेल प्रवर्धन prolongs और इस प्रकार हमें जल्दी progenitors की बड़ी संख्या के साथ प्रदान करता है (जीनोमिक्स और प्रोटिओमिक्स अध्ययन के लिए आवश्यक) को जोड़ती है , और एमएस 5-mesenchymal कोशिकाओं है, जो हीमोग्लोबिन संश्लेषण को अधिकतम करने और लाल रक्त कोशिकाओं की पूरी enucleation प्राप्त के लिए महत्वपूर्ण है पर एक सह संस्कृति के दूसरे चरण के. हमारे विधि के दो सीमाओं 1) भेदभाव के जल्द से जल्द चरणों में प्रवर्धन की डिग्री अभी भी अपर्याप्त है, जो अब तक हमें रोका गया है पूरी तरह से प्रोटीन के स्तर पर और 2) इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन के उच्च लागत पर बहुत जल्दी erythroid progenitors विशेषताएँ हैं, विशेष रूप से एक बड़े पैमाने पर.
पूर्व vivo erythroid भेदभाव के लिए सेल संस्कृति अभिकर्मकों और साइटोकिन्स की गुणवत्ता जरूरी है. विशेष रूप से, एक सीरम स्थानापन्न के रूप में थोड़ा (तालिका 2) का उपयोग महत्वपूर्ण है. दरअसल हमारे अनुभव में थोड़ा का उपयोग बैच बैच भिन्नरूपों कि हम पहले अनुभवी (संभावना अभिकर्मक पवित्रता में मतभेद के कारण) जब गोजातीय सीरम albumin, इंसुलिन और transferrin की अलग - अलग स्रोतों का उपयोग कर समाप्त. एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु MS-5 erythroid कोशिकाओं के सह संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया परत की गुणवत्ता है. दरअसल, एमएस 5-कोशिकाओं को 70% मिला हुआ हो सकता है जब erythroid कोशिकाओं और जोड़ रहे हैं और हर 3-4 दिनों से परिवर्तित किया जाना चाहिए चाहिए. यदि एमएस -5 कोशिकाओं को भी मिला हुआ हैं, erythroid कोशिकाओं को बढ़ने और ठीक अंतर नहीं होगा. इसके अलावा, अस्वास्थ्यकर एमएस -5 कोशिकाओं अलग, erythroid कोशिकाओं की कटाई मुश्किल बना देते हैं.
पिछले विधियों संस्कृति में hematopoietic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में जीन डिलीवरी के लिए retrovirus का इस्तेमाल किया है. हालांकि, रेट्रोवायरस केवल विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित और इसलिए मुख्य रूप से मौन CD34 + गर्भनाल रक्त, अस्थि मज्जा या 20 leukapheresis से अलग कोशिकाओं को संक्रमित करने में कुशल नहीं हैं. जीन डिलीवरी के लिए lentiviral दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि यह कोशिकाओं उनके प्रसार 7,21 स्थिति के स्वतंत्र के एक कुशल संक्रमण की अनुमति देता है. हमारी lentiviral की मध्यस्थता जीन डिलीवरी की अनुमति देता है कुशलतापूर्वक पछाड़ना या खत्म-व्यक्त विशिष्ट प्रतिलेखन कारक है कि सेल भाग्य को संशोधित कर सकते हैं. उपयुक्त प्ररूपी विश्लेषण (सेलुलर और आणविक) विशेष phenotypes प्रकट संक्रमण के बाद तैयार किया जा सकता है है. इसके अलावा, विकास शर्तों के संक्रमण के बाद विशेष सेल प्रकार एहसान बदला जा सकता है. इन पंक्तियों के साथ, इस प्रोटोकॉल में हम किसी भी विधि का प्रयोग नहीं करने के लिए दो मुख्य कारणों के लिए lentivirus संक्रमित कोशिकाओं का चयन करने के लिए चुना है: 1) हमारी संक्रमण क्षमता बहुत अधिक है (चित्रा 6C) और 2) हम चिंतित हैं कि विधि का चयन किया lentivirus संक्रमित कोशिकाओं (जैसे सेल छँटाई या एंटीबायोटिक) जीवित / proliferating कोशिकाओं है कि या तो एंटीबायोटिक प्रतिरोध या जिससे एक संभावित apoptotic phenotype छुपा उच्च स्तरों पर मार्कर फ्लोरोसेंट जीन व्यक्त कर रहे हैं की दिशा में पक्षपाती हैं.
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हम पूर्व vivo erythroid भेदभाव, डी. एलन और एच. Atkins (Ohri, कनाडा) पर रक्त के नमूनों (ओटावा अस्पताल रिसर्च एथिक्स बोर्ड के तहत प्राप्त प्रदान करने के लिए सलाह के लिए एल Douay और एम सी Giarratana (Université पेरिस छठी, फ्रांस) धन्यवाद # ) 2007804-01H, डी. (इकोले पॉलीटेक्निक Federale डी लॉज़ेन) Trono गंभीर पांडुलिपि पढ़ने के लिए lentiviral वैक्टर और FJ Dilworth (Ohri, कनाडा) प्रदान करने के लिए. यह परियोजना एक CIHR अनुदान (एमओपी 82,813) के द्वारा MBCGP वित्त पोषित किया गया था एक ओंटारियो रिसर्च फंड कम्प्यूटेशनल Regulomics प्रशिक्षण Postdoctoral फैलोशिप के एक प्राप्तकर्ता है. MB जीन अभिव्यक्ति के नियमन में कनाडा अनुसंधान चेयर रखती है.
