Aktivitesi miktarının Cis Düzenleme Elemanları

1. Elektroporasyon odasının İnşaatı

1. 3.2mm aralıkla (Harvard Apparatus # 45-0105) (Şekil 2A) microslide, BTX Model 453 sipariş edin. Metal raylar tamamen slayt alt mühürlü olmalıdır.
2. Dremel aleti, plastik bir mikrosantrifüj tüp raf kapalı bir kolu kesmek için kullanın. Kolu 0.8cm uzunluğunda, yüksekliği 0.6cm, genişlik 0.3cm (Şekil 2B): Her aşağıdaki boyutları ile 5 küçük dikdörtgen parçalar halinde kesin. Bu plastik parçaları, yeniden kullanılabilir ayırıcılar microslide odasında ayrı ayrı kuyu kalıp kullanılacaktır.
3. Microslide metal raylar arasında eşit aralıklarla plastik ayırıcılar yerleştirin. Ayırıcılar (Şekil 2C) rahatça sığacak.
4. P200 pipet ucu kapalı Kes, 3ml şırınga ucu uygun ve% 100 silikon kauçuk akvaryum dolgu ile şırınga doldurun. Dolgu ile plastik ayırıcılar arasındaki boşlukları doldurun. Kabarcıklar mastik fiş ve microslide tabanı arasında oluşturduğu alt boşlukları doldurmak için emin olun.
5. Ayırıcılar yerinde tutulur, böylece plastik ayırıcılar tepesinde metal bir çubuk yerleştirin ve bağlayıcı klipleri ile tutturmak mastik kurur (Şekil 2B-E). Mastik gecede kurumasını bekleyin.
6. Bağlayıcı klipleri, metal çubuk ve plastik ayırıcılar (Şekil 2F) çıkarın. Metal raylar üst kapalı mastik temizlemek için bir neşter bıçak kullanın. Microslide incelemek ve kabarcıklar, silikon baraj altındaki mevcut olduğundan emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. Çıplak metal kuyuların içinde maruz kaldığı bu tür kuyuların oluşmuş olabilecek herhangi bir dolgu filmi çıkarın. Su ile doldurun ve bitişik iyi (ler) suyun içine sızıntı olmadığından emin olun. Tüm kuyuları için tekrarlayın.
7. Bitmiş microslide plastik tabak çanağı yan pencere (Şekil 2G) komşu metal direkleri ile uyar; elektrotlar sonunda metal direkleri eklenecektir.

2. DNA hazırlığı

1. Plazmid DNA, buz üzerinde bir 1.5mL mikrosantrifüj tüp ekleyin ve saf su ile 150μl ses getirmek. Çoklu plazmid türlerin ortak elektroporasyon (örneğin, bir deney DsRed inşa ve kontrol GFP inşa) için kombine olabilir. Tüp DNA kısım son hacmi 60μl olacağını akılda tutmak için DNA miktarını hesaplarken. Tipik olarak, her yapı 0.5μg/μl son bir konsantrasyonda kullanılır.
2. 15μl 3M sodyum asetat (pH 5.2) ve 450μl% 100 etanol eklenerek DNA çöktürün. Karıştırmak için birkaç kez çevirin ya da tüp dokunun.
3. 4 DNA Spin ° C, 13.200 rpm, 30 dakika boyunca. Pelet% 70 etanol ile yıkayın, sonra tekrar 4 aşağı dönmeye ° C, 13.200 rpm, 15 dakika boyunca. Hava kuru pelet yarı şeffaf kadar, yaklaşık 7 dakika sonra 54μl steril su tekrar süspansiyon haline getirin. 6μl steril 10X PBS (pH 7.4) ve karışımı ekleyin.

3. Göz toplama

1. Elektroporasyon odası ve% 70 etanol ile tüm aletleri sterilize edin. Göz toplama ve diseksiyon bir doku kültürü kaputu gerekmez iken, eldiven ve etanol ve steril koşullar işlem boyunca korumak için çalışır benchtop dezenfekte edin.
2. 3ml orta ve biri ile her iki 35mm yemekler: diseksiyon orta (: F12, 100U/ml penisilin, 100μg/ml streptomisin, 0.29mg/ml L-glutamin ve 5μg/ml insülin 01:01 DMEM oranı) ile Petri kapları hazırlayın 6ml orta ile 60mm çanak. Bu adım, bir doku kültürü kaputu yapılmalıdır.
3. Yeni doğmuş bir baş ve boyun (postnatal gün 0)% 70 etanol ile yavru fare dezenfekte edin. Makas ile hızlıca başını kesmek ve steril bir 100mm çanak baş aktarmak.
4. Gözleri ortaya çıkarmak için küçük makas ile kafa derisi kesilip. Kavisli bir forseps yavaşça yörüngesinin göz kaşık kullanın ve 35mm çanak diseksiyonu orta içeren bir göz. Bu düşük güçte bir diseksiyon mikroskobu altında gözleri kaldırmak için yararlı olabilir.
5. Tüm gözler toplanıncaya kadar 3.3 ve 3.4 adımları tekrarlayın. Diseksiyonu orta gözleri diseksiyon ise oda sıcaklığında tutun. DNA kısım başına 3-4 gözleri gerekecektir.

4. Retina diseksiyonu

1. % 70 etanol, jilet ve steril bir plastik transfer pipetin wrapper dezenfekte etmek için kullanın. Bıçak ile pipet ucu kapalı bir bütün göz emmek böylece kesin. Pipet kullanılmadığı zaman plastik ambalajında ​​saklayın.
2. 60mm, 35mm çanak çanak bir göz aktarın. Yüksek güçte diseksiyon mikroskobu altında, göz yüzeyinde, ekstraoküler kas ve yağ olarak, herhangi bir doku kaldırmak için ince forseps kullanabilir. Daha sonra, optik sinir üssünde kapalı kısma çıkarın.
3. Retinanın izole etmek için, küçük bir delik prize ilimbus sklerasına n. Forseps iki çift uçlu bir delik (retina yüzeye teğet) yerleştirin ve hafifçe açmak sklera / RPE gözyaşı. Albino farelerde, sklera ve RPE retina dokusu, homojen mat gri renkte parlak akraba görünür. Pigmentli farelerde, RPE siyahtır. Objektif bir yerde bırakın.
4. Disseke retinanın orta ile diğer 35mm çanak içine taşımak için transfer pipet kullanın.
5. Tüm gözler disseke kadar 4.2 ve 4.4 için gerekli adımları tekrarlayın.
6. Electroporate için hazır olana kadar 37 ° C doku kültürü inkübatör retina saklayın.

5. Elektroporasyon için hazırlanması

1. Orta 35mm yemekleri hazırlayın. Electroporated her DNA kısım için, diseksiyon orta bir çanağı ve kültür ortamı, bir çanak (diseksiyon orta artı% 10 FBS) ihtiyacınız olacak. Uygun yemekler Etiket.
2. P200 pipet ve steril 1X PBS elektroporasyon çanak odaları yıkamak için kullanın. Her odasına 60-100μl bir hacme sahiptir. Her iki meclisin de üç kez yıkayın.
3. DNA alikotları odaları doldurun. Herhangi bir kullanılmayan odaları 60μl 1X PBS ile dolu olmalıdır. Elektroporasyon çanak elektrotlar bağlayın.
4. Elektroporatör aşağıdaki ayarları kullanın: modu, AG, voltaj, 30V, darbe uzunluğu, 50 msn, bakliyat, 5 sayısı aralığı 950 msn; polarizasyon, tek kutuplu.

6. Elektroporasyon

1. Ince forseps lens retina kavramak ve elektroporasyon odaları içine aktarmak için kullanın. Her odasına 3-4 fare retina (Şekil 3) kadar tutar.
2. Objektif, pozitif elektrot için metal çubuğu ile içiçedir retina sıraya forseps kullanın. Odasından bir sonraki DNA üzerinden devam önlemek için her transferinden sonra bir Kimwipe forseps temizleyin.
3. Tüm retina hizalanır sonra, Elektroporatör üzerinde "Başlat" tuşuna basın. Küçük kabarcıklar, negatif elektrot için bağlı metal çubuğu oluşturmalıdır.
4. Elektrotlar çıkarın ve kapatın Elektroporatör.
5. Forseps yavaşça odanın duvarları uzak retina taşımak için kullanın.
6. Diseksiyonu orta içeren 35mm yemekleri odalarından retina aktarmak için steril bir transferi pipet kullanın.
7. Her iki meclisin de steril 1X PBS ile üç kez yıkayın, daha sonra steril su ile durulayın. % 70 etanol ile Sprey çanak.

7. Kültür için filtreler retina yerleştirilmesi

1. Kültür ortamı içeren 35mm yemekleri retina aktarmak için bir transfer pipet kullanın.
2. Etiket ve steril 6-iyi bir kültür plaka kuyu 3ml kültür ortamı ile her iyi doldurun.
3. Orta tepesine kadar yuvarlak whatman Nuclepore filtreler, parlak tarafı, her iyi steril forseps kullanın.
4. Diseksiyon mikroskobu altında, filtre, lens tarafı aşağı üzerine retina aktarmak için steril bir transferi pipet kullanın. Retina toprakları objektif-yan-up, pipet ve tekrar yere girişimi ile pick up. 4 retina fazla bir filtre yerleştirin ve her bir retina çevresindeki orta damlacıkları diğer damlalarla ayrı kalacağından emin olun. Diğer protokolleri önce bu adımı ⁹ lens çıkarılması için çağrıda rağmen, bozulmamış lens ile kültür retina unutmayın.
5. 37 kültür plakasına yerleştirin ° C doku kültürü inkübatör (% 5 CO ₂₎ ve zaman istenilen miktarda, genellikle sekiz gün için büyümek. Bir ortam değişikliği, uzun kültürü süreler için gerekli olabilir, ancak bizim deneyim, orta değişen sekiz günlük kültür döneminde gereksizdir.

8. Hasat ve floresan retina eksplantlar flatmounting

1. % 4 paraformaldehid / 1X PBS ile her kuyuda kültür ortamı değiştirin. Retina, filtrelere takılıp kalırsa, filtre kapalı retina kabuğu hafifçe üzerindeki filtreler çevirmek için forseps kullanabilir ve. Için paraformaldehid de 30 dakika inkübe edin. oda sıcaklığında. Floresan beyazlatma önlemek için ışık retina koruyun.
2. Retina 1X PBS içinde 10 dakika boyunca iki kez durulayın.
3. Retina PBS küçük bir damla, bir cam slayt üzerine aktarmak için bir pipet kullanın. Electroporated yan böylece floresan bir diseksiyon mikroskobu altında (yani, objektif tarafı aşağı) retina çevirmek için forseps kullanabilir.
4. Yeri cam slayt köşeleri ezilmiş lamelleri (yaklaşık 1-2 mm çapında cam kırıkları) yapılan "feet"; bu ayaklar retinanın düzleştirme önlemek. Ayakları üzerinde retina ve dinlenmeleri kapsar ve böylece slayt üzerinde sağlam bir cam lamel yerleştirin. Gerekirse, slayt ve lamel arasında daha PBS eklemek için bir pipet kullanın.

9 - Görüntüleme ve flatmount floresans ölçümü

1. Bir kullanın.floresan bileşik mikroskop, görüntü kırmızı ve yeşil kanalları düşük güç (4X objektif) flatmounted retinanın bir siyah-beyaz kamera ile donatılmıştır. Tüm retina floresan yoğunluklarına göre etkinleştirmek için, belirli bir floresan kanal için aynı pozlama süresi ile görüntülü olmalıdır. Herhangi bir resmi piksel doymuş, ya da başka bir doğru kantifikasyon imkansız olacaktır emin olun. İhracat görüntüleri TIFF formatında gri tonlama.
2. ImageJ yazılımı (retina (yani .., kırmızı kanalı ve yeşil kanal) görüntüyü açın http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). Bu yazının uğruna, yeşil flüoresan kanal (GFP protein), deney tüm retina üzerinde sabittir kontrol yapıdır. Kırmızı floresan kanal (DsRed protein), retina her set için değişir deneysel bir yapıdır. Gri tonlamalı görüntüler olmalıdır.
3. ImageJ, kontrol yeşil görüntüyü seçmek ve çapı 100 birim (Analiz / Araçlar / ROI yöneticisi / / belirtin) ile ilgi bir daire belirtin. Toplam sekiz çevreler oluşturmak için bu daire (ROI yöneticisi / Ekle) çoğaltın. Kaçınarak, retina ve lens (Şekil 4A) üzerinde bölgenin dış kenarları düzgün electroporated beş bölge seçmek için çevrelerde 1-5 taşıyın. Ayrıca, retina / eşiğe ölçmek için objektif üç bölge dışında (daireler 6-8) seçin. Kırmızı görüntü seçin, ROI yöneticisi kutusu "Tümünü göster" ve tekrar kontrol edin kutunun kontrol edin. Tüm sekiz daire kırmızı görüntü görünmelidir. De seçin tüm daire ROI yöneticisi koordine eder.
4. Ölçümleri 1-8, 1-5, kırmızı retina ölçümleri ve 6-8 kırmızı zemin ölçümleri görünmelidir; kırmızı bir görüntü seçildiğinde, (ROI yöneticisi / Tedbir) ilgi her daire için ortalama piksel değeri kaydetmek. Yeşil bir görüntü seçin ve ortalama piksel değeri kaydetmek; ölçümleri 9-16, 9-13, yeşil retina ölçümleri ve 14-16 yeşil arka plan ölçümleri görünmelidir. Excel'e analizi için ölçüm verileri (Şekil 5) kopyalayın.
5. Ortalama üç kırmızı hem de arka plan ölçümleri ve yeşil kanallar. Kırmızı kanal beş retina ölçümlerin her kırmızı arka plan ortalama çıkarma, yeşil kanal için tekrarlayın. Her bir retina bölge çıkarları için, kontrol yeşil seviyesi (Şekil 5) deneysel kırmızı seviyesi normale döndürmek için, arka plan çıkarılır yeşil ölçümü ile arka plan çıkarılır kırmızı ölçüm bölün .
6. Belirli bir DsRed oluşturmak (örneğin, retina kez 3 ayrı retina başına 5 ölçüm) için normalize bütün ölçümlerin ortalama ve standart sapma belirleyin. Kantitatif farklı günlerde gerçekleştirilen electroporations sonuçları karşılaştırmak için, her zaman her elektroporasyon set bir "standart" DsRed / GFP yağış içerir. Bu ifade seviyesine normalize deneyler göreceli ifade değerleri mukayese edilebilir "standart."

10 Temsilcisi Sonuçlar:

Retina yüzeyinin 1 / 3 1 / 4 çapında DNA yapı (lar) (Şekil 4A) ifadesi iyi bir elektroporasyon sonuçları. Özellikle çubuk fotoreseptör verimli transduced olduğundan, bu tekniğin fotoreseptör spesifik promotor aktivitesi (Şekil 4B) ölçülmesi için idealdir. Daha önce özel çubuk Rho ve Gnat1 lokusların ¹⁰ organizatörü varyantlarının aralığını ölçmek için bu yaklaşımı kullanmıştır. Biz neredeyse 300 kat aralığı üzerinde promotor aktivitesi ölçmek mümkün olduğunu bulundu.

Şekil 5, tek bir electroporated retinanın bir örnek veridir. Bu özel örnekte, deneysel inşa pNrl (1.1kb) DsRed kırmızı kanal ölçüldü ve kontrol inşa pNrl (3.2kb)-GFP yeşil kanal ölçüldü. PNrl için tam bir veri kümesi (1.1kb) DsRed bir yapı, bu şekilde ölçülen 6-9 retina oluşacak ve tüm değerleri "GFP için normalize DsRed" standart sapma göre hesaplanır olacaktır. PNrl ifade seviyesi (1.1kb) DsRed için karşılaştırarak olsaydı, örneğin, pNrl (0.8kb) DsRed, daha sonra her iki yapıları aynı GFP kontrolü (örneğin, pNrl (3.2kb) electroporated olması gerekir - GFP) ve görüntülü aynı pozlama süreleri. Bu, bir standart DsRed / GFP elektroporasyon (örneğin, pNrl (3.2kb) dsRed + pNrl (3.2kb)-GFP) her gün farklı günlerde toplanan havuzu veri mümkündür . Her deneysel bir yapı için, normalize DsRed seviyesi, daha sonra "standart" (pNrl (3.2kb) dsRed) normalize DsRed seviyesine normalize olacaktır.

Biz burada açıklamak teknik fotoreseptör Cres ^10,13 faaliyet ölçülmesi için özellikle yararlıdır.Hücre tipi özel cis-düzenleyici aktivite gibi bipolar hücreler ¹⁴ gibi nadir retinal hücre tiplerinde de sayılabilir veriler, ancak bu genellikle sayısal ilgi alanlarında flatmount hazırlıkları ziyade dikey kesitler seçilmiş olması gerekir. Aynı, fotoreseptör ve bipolar hücreleri gibi çok sayıda hücre tipleri ifade sürücü Cres doğrudur. Deneysel prosedürleri, aksi takdirde benzer.

Şekil 1 retina eksplant elektroporasyon prosedürü genel bakış. Öncelikle, tüm gözler postnatal gün 0 fare yavrular izole edilir ve retina (P1) disseke. İkincisi, retina, DNA ve electroporated (P2) ile dolu odalarına yerleştirilir. Üçüncü olarak, retina filtreler yerleştirilir ve sekiz gün (P3) kültüre. Dördüncüsü, retina eksplantlar, sabit kızaklar üzerinde monte edilmiş ve görüntülü vardır. Floresans şiddeti ImageJ yazılımı (P4) ile ölçülür. Beşincisi, ImageJ veriler çeşitli rehberleri (P5) faaliyet farkı ölçmek için bir elektronik tablo programı işlenir.

Şekil 2 elektroporasyon çanak yapımı. A) Harvard Apparatus, BTX modeli 453 (katalog # 45-0105) Değiştirilmemiş microslide odası. B) Bir Dremel aleti, plastik bir tüp raf kapalı kolu kesmek için kullanılır. : 0.8cm uzunluk, yükseklik 0.6cm, genişlik 0.3cm kolu aşağıdaki boyutları ile dikdörtgen ayırıcılar içine kesilir. C) plastik ayırıcılar, eşit aralıklarla microslide odasına donatılmıştır. Akvaryum mastik aralayıcılar (gösterilmemiştir) arasındaki boşluklar içine enjekte edilir. D) Bir metal çubuk ayırıcılar üzerine yerleştirilir. E) bar ve ayırıcılar gecede mastik kurur olarak her şeyi yerinde tutmak için bağlayıcı klipleri slayt üzerine kenetlenir. F) ayırıcılar kaldırılır ve kuyulardan su geçirmez olduğunu sağlamak için test edilmektedir. G) bitmiş slayt ile plastik tabak çanağı yan pencere komşu metal çubuklar içine sığar.

Şekil 3 retina ile elektroporasyon çanak diyagramı. Odaları DNA çözümleri (bir defada en fazla beş farklı çözümler) ile doldurulur. Beş odalarının her birinde üç ya da dört retina uyacak; retina odaları ve odaklı objektif, pozitif elektrot için metal çubuğu yaslanmış şekilde yerleştirilir. Negatif yüklü DNA molekülleri elektrik akımı retina hücreleri içine taşımak için neden olacaktır.

Flatmount retina floresan düzeyleri Şekil 4 A) ImageJ ölçüm. , Bu görüntüleri sadece bilgi amaçlıdır için renkli olduğuna dikkat edin; DsRed (deneysel) ve GFP (kontrol) kanalları ImageJ yazılım açıldı flatmount gri tonlamalı görüntüler. Beş ölçüm daireler (1 ile 5), kenarları ve lens (noktalı çizgiler) kaçınarak, düzgün electroporated bölgeler üzerinde yerleştirilir. Üç ölçüm çevreler (6 ile 8 arasındaki), arka plan floresan düzeylerini belirlemek için retina dışına yerleştirilmiş. B), yüksek güçte bir electroporated retina eksplant kesitsel görüntüler. Eksplant 4 gecede% 30 sucrose/1X PBS cryoprotected postnatal gün 8 ° C, OCT gömülü sabit ve 12μm az cryo-kesitli oldu. Floresan yapıları pNrl (1.1kb) DsRed ve pNrl (3.2kb)-GFP fotoreseptör hücrelerinin dış nükleer tabaka (onl) olarak ifade edilir. INL, iç nükleer tabaka; GCL, ganglion hücre tabakası.

Şekil 5 Excel kullanarak floresan verilerin işlenmesi. 1. adımda, her bir ölçüm daire için ortalama piksel değeri tablo (hücre B3-B12, F3, F5, H3-H5) kopyalanır. Ölçümler # 1-5 DsRed retina değerleri ve 6-8 DsRed arka plan değerleri; ölçümleri # 9-13 GFP retina değerleri ve 14-16 GFP arka plan değerlerdir. Not ölçüm # 1 ve # 9 ölçümleri # 2 ve # 10 gibi, aynı ölçüm daireye karşılık gelir ve bu. 2. adımda, DsRed ve GFP kanallar için ortalama temel değeri (hücre F6, H6) hesaplanır. 3. adımda, her retina ölçüm ortalama arka plan çıkarılır (hücre C3-C12). 4. adımda, her DsRed ölçüm karşılık gelen GFP ölçümü (hücre D3-D7) normalize arka plan çıkarılır.