Método de aglutinação de partículas de Identificação Poliovirus

1. Preparação de meio de manutenção (MM) e de crescimento médio (GM)

Para a preparação de MM e GM, consulte um manual de laboratório Poliomielite da OMS ^1. Meio modificado Dulbecco Águia (DMEM) suplementado com 2% de soro fetal bovino (FCS) e 10% FCS podem ser utilizados como substitutos de MM e GM, respectivamente.

2. Preparação de anticorpos anti-PV

1. Anticorpos anti-PV reconstituir (RIVM PV digitando anti-soro) por adição de água (0,5 mL por frasco) para cada frasco de anticorpo anti-PV (tipo 1, 2 ou 3). Adicionar este soluções de anticorpos reconstituída (0,5 mL cada) para 4,5 mL de MM em separado tubos rotulados.
   Nota: Alguns lotes de anti-PV anticorpos são fornecidos como forma reconstituída (0,5 mL por frasco). Para o lote de tais anticorpos anti-PV, além de água para a reconstituição não é necessário.
2. Mix volume igual de anticorpos anti-PV reconstituído. Para anti-PV1 +2, 2 +3, ou 3 +1: Misture 1,8 mL de cada anticorpo reconstituída (1,8 mL + 1,8 mL = 3,6 mL para cada mistura). Para anti-PV1 +2 +3: Misture 1,2 mL de cada anticorpo reconstituída (1,2 mL + 1,2 mL + 1,2 mL mL = 3,6).
   Nota: As amostras de PV poderia conter uma mistura de diferentes sorotipos do PV. Para identificar o sorotipo único do PV em amostras com mistura de PVs, piscinas de anticorpos anti-PV (isto é, 1 +2, 2 +3, 3 +1, 1 +2 +3) é necessário.
3. Adicione 1 / 5 do volume de FCS (0,72 mL) para cada anti-PV (1 +2, 2 +3, 3 +1, ou 1 +2 +3) de anticorpos (3,6 mL cada) (final FCS 18,2%).
   Nota: A adição de FCS é para a redução das não-específicas aglutinação de partículas de gelatina causada por anticorpos.
4. Manter o piscinas de anticorpos a -20 ° C até o uso no ensaio PA.

3. Reconstituição de partículas de gelatina sensibilizadas

1. Adicione 1,5 mL de tampão de reconstituição incluído no kit para um frasco de partículas de gelatina sensibilizadas (fornecido como pó liofilizado).
2. Misture bem tocando suave
3. Mantenha a partícula reconstituído sensibilizados a 4 ° C. De partículas de gelatina reconstituída pode ser ativo, pelo menos, duas semanas mantido a 4 ° C, mas deve ser preparado antes do ensaio.

Nota importante:
Não misture muito diferentes de partículas de gelatina sensibilizadas, porque a imagem não de aglutinação de partículas de gelatina sensibilizadas poderia ser diferente pela grande quantidade de partículas. Para cada experimento, um único lote de partículas de gelatina sensibilizadas deve ser usado.

4. PA ensaio para identificação PV

1. Prepare uma placa de micro titulação. Para a identificação de uma amostra de vírus, precisamos de 5 poços +, pelo menos, um controle negativo (partículas sensibilizadas sem vírus e de anticorpos, bem # 6 em abaixo. See No controle de vírus e anticorpos no Exemplo). Número total de poços é de 5 x + amostras controle de pelo menos um no ensaio.
   Nota importante:
   Por favor, tome pelo menos um controle Nenhum vírus e anticorpos no ensaio. Um frasco de partículas é de aproximadamente sensibilizados para a identificação de 10 amostras de vírus.
2. Adicione 12 mL / poço de anticorpo anti-PV ou GM para a placa micro-titulação. O arranjo do prato é a seguinte (Veja também Exemplo abaixo). Em amostras sem anticorpos (bem # 1 e 6), adicionar 12 mL da GM, em vez de anti-PV anticorpos.
   Nota importante:
   Se muitas amostras PV deve ser testado neste ensaio, pipeta multicanal ou dispensador seria útil para esta etapa.

   Bem # 1	Bem # 2	Bem # 3	Bem # 4	Bem # 5	Bem # 6
   GM	anti-P1 +2 +3	anti-P1 +2	anti-P2 3	ani P1-3	GM

3. Adicione 12 mL / poço de amostra de vírus. Em uma amostra sem vírus (bem # 6), adicionar 12 mL da GM, em vez de solução de vírus.
   Nota: a amostra do vírus é sobrenadante de cultura de células infectadas, células normalmente L20B ou células RD.
   Nota importante:
   Se muitas amostras PV deve ser testado neste ensaio, pipeta multicanal seria útil para esta etapa.

   Bem # 1	Bem # 2	Bem # 3	Bem # 4	Bem # 5	Bem # 6
   amostra de vírus	amostra de vírus	amostra de vírus	amostra de vírus	amostra de vírus	GM

4. Tome solução reconstituída de partículas sensibilizadas a partir de 4 ° C até a temperatura ambiente e bata suavemente completamente suspender as partículas.
   Nota importante:
   Após a suspensão completa das partículas agitando ligeiramente, as partículas devem ser adicionados imediatamente para as placas antes da precipitação de partículas suspensaste e formam solução não-homogênea.
5. Adicionar 25 mL / poço de partículas sensibilizadas para todos os poços.
   Nota importante:
   Após a adição de partículas sensibilizadas, a placa deve ser imediatamente submetido a placa de mistura para iniciar a reação uniforme das amostras. Portanto, a adição de partículas sensibilizadas deve ser realizada usando dispenser para minimizar um intervalo de tempo entre as amostras na placa.
6. Coloque a placa de micro-titulação em um misturador de prato e misture a placa por 30 segundos.
7. Coloque a placa de micro-titulação em papel branco (para facilidade de observação visual) em uma mesa à temperatura ambiente (15 ~ 30 ° C) por 2 h.
   Nota importante:
   Não mova a placa durante e após a reação para a observação dos resultados e tirar fotos. A aglutinação formado não é estável e facilmente perturbadas movendo as placas.
8. Tirar fotos do prato.
   Nota importante:
   Vista parcial das fotos não poderia dar dados suficientes para posterior exame e análise dos resultados para a interpretação. Várias fotos devem ser tomados para cobrir todos os poços das placas com foco na imagem de aglutinação dos poços.

5. Interpretação dos resultados

1. Identificação de poços positivos e negativos. Compare a aglutinação nas amostras com o de Sem controle de vírus e de anticorpos (precipitação de partículas de gelatina, a aglutinação não) (Figura 1 e 2). Imagens de aglutinação que são claramente distinguidos das Nenhum vírus e sem controle de anticorpos (não-aglutinação, controle negativo) deve ser considerada positiva, e as imagens de aglutinação que são semelhantes ao controle negativo deve ser julgado como negativo. Exemplos que mostram aglutinação clara, mas apenas parcial pode ser considerada positiva, mas gravar como "positivo (aglutinação parcial).
2. Identificação do PV. Interpretar os resultados com base em poços positivos e negativos com anti-PV anticorpos para identificar os sorotipos PV. Princípio da interpretação do resultado é semelhante ao do teste de neutralização em sistema de cultura de células (por exemplo, positivo para anticorpos anti-P1 2 indica que a amostra contém o tipo 3 PV).

6. Resultados representante

Resultado representativo da PA ensaio PV identificação é mostrado na Figura 1. Todas as cepas PV formado aglutinação de partículas de gelatina sensibilizadas (Nenhum anticorpos amostras). Na presença de correspondentes anti-PV anticorpos, precipitação de partículas de gelatina (aglutinação não) semelhante ao Nenhum vírus e sem controle de anticorpos (controle negativo) foi observada (por exemplo, PV1 (Sabin), na presença de anti-P1 +2 ou anti-P3 uma anticorpos).

Figura 1. Identificação de PV por ensaio PA. Soluções Virus de PV1 (Sabin), PV2 (Sabin), e PV3 (Sabin) (títulos de vírus de 1,2 x 10 ⁸ CCID ₅₀ / 12 mL, 8,2 x 10 ⁷ DICC mL _50/12, e 3,5 x 10 ⁷ DICC ₅₀ / 12 mL, respectivamente) foram utilizados para a identificação através do teste de PA. Nenhum vírus e sem controle de anticorpos mostraram precipitação de partículas de gelatina (não-aglutinação controle negativo).

Figura 2. Interpretação dos poços de positivo e negativo. Soluções Virus de PV1 (Sabin), PV2 (Sabin), e PV3 (Sabin) (títulos de vírus de 2,4 x ⁸ CCID 10 L _50/25, 1,7 x 10 ⁸ mL CCID ₅₀ / 25, e 7,3 x 10 ⁷ DICC mL _50/25, respectivamente) foram diluídos 1 / 20 a 1 / 320, e em seguida 25 mL de amostras diluídas foram examinados por ensaio PA sem anti-PV anticorpos.

O único ponto deste ensaio PA é a utilização da molécula de PVR em vez de anticorpos anti-PV para a detecção de PV 2. Isso permite uma interação específica das partículas sensibilizadas gelatina com PV com uma afinidade uniforme para todos os três sorotipos do PV ^3-6. Nós usamos uma forma immunoadhesin de PVR (PVR-IgG2a) para a sensibilização das partículas de gelatina, porque as formas monoméricas de PVR têm apenas afinidades moderada para o único local de ligação do vírion (constante de dissociação de 10 ^{-7 ~ -8} M) ^{7, 8,} e com sucesso observada aglutinação específica das partículas de gelatina sensibilizadas com isolados PV. Com a alta especificidade e afinidade uniforme das partículas sensibilizados, os fatores críticos de identificação PV no ensaio PA são: 1) título do vírus (para detecção válido de PV por ensaio PA) e 2) a interpretação de aglutinação (para a correta identificação do PV) .

Geralmente, o vírus título de PV isolados em cultura de células do sistema está em um intervalo de ^{06-8 outubro} CCID ₅₀ / ₅₀ mL. Os limites de detecção do ensaio PA (formando aglutinação completa) para o tipo 1, 2 e 3 PV foram 1.5x10 ⁶ CCID _50, 5.3x10 ⁵ CCID _50, e 9.1x10 ⁵ CCID _50, respectivamente ^2. O ensaio PA identificou corretamente a maioria das cepas PV, mesmo na presença de outros enterovírus não-PV. No entanto, para algumas amostras continham uma mistura de diferentes sorotipos do PV, o sorotipo menores deixou de ser detectado. Aglutinação clara deve ser formado com título de vírus suficiente acima dos limites de detecção. No caso da aglutinação de anticorpos Nenhuma amostra foi claro ou parcial, os isolados devem ser re-amplificado em células RD para aumentar o título ^9.

Aglutinação parcial foi observado quando o título do vírus foi baixa e apenas abaixo dos limites de detecção. Clara diferença de aglutinação do controle negativo poderia ser considerada positiva no ensaio PA. No entanto, a diferença muito sutil da aglutinação considerada positiva poderia induzir a interpretação dos resultados. Portanto, os resultados da Positivo (aglutinação parcial) deve ser utilizado como informação de apoio para possivelmente causada por sorotipos menores dos isolados. No entanto, esta informação seria útil quando a análise a seguir (sequenciamento genômico de isolados PV ou em tempo real de RT-PCR) sugeriu a possibilidade de que a amostra continha uma mistura de diferentes sorotipos de PV, ou apenas de aglutinação parcial foi observado para Nenhuma amostra anticorpos, onde o título de vírus de baixa seria a principal causa dos resultados pouco claros.

A vantagem do PA ensaio para identificação PV está na simplicidade da interpretação procedimento e resultado. Isso permitiria a introdução fácil de ensaio para todos os laboratórios a realização de isolamento PV com o sistema de cultura de células, sem fornecer equipamentos especiais, materiais e treinamentos. Utilização do tipo de anticorpos monoclonais específicos pode permitir o desenvolvimento de novo método para a diferenciação de PVs (tipo selvagem ou vacina-como cepas) que fornecem informações importantes sobre a propriedade do PV isola junto com a diferenciação genética por RT-PCR e genômica seqüenciamento ^{10, 11.}