El trasplante quirúrgico de células madre neurales en la médula espinal de los ratones infectados con el virus neurotrópico Hepatitis Ratón

Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834, doi:10.3791/2834 (2011).

Los ratones infectados con la cepa JHM neurotrópico del virus de la hepatitis del ratón (MHV) desarrollar los resultados patológicos y clínicos similares a los pacientes con la enfermedad desmielinizante Esclerosis Múltiple (EM). Hemos demostrado que el trasplante de NSCs en la médula espinal de los resultados de los ratones enfermos en una mejora significativa tanto en la remielinización y en los resultados clínicos. Terapias de reemplazo celular para el tratamiento de las enfermedades crónicas neurológicas son ya una realidad y en modelos in vivo son de vital importancia en la comprensión de las interacciones entre las células injertadas y el microambiente del tejido huésped. Esta presentación ofrece un método adecuado para el trasplante de células en la médula espinal de ratones infectados JHMV. En resumen, ofrecemos un procedimiento para i) la preparación de NSCs antes del trasplante, ii) pre-operatorio de atención de los ratones, iii) la exposición de la médula espinal a través de una laminectomía, iv) la inyección estereotáxica de NSCs, y iv) los cuidados postoperatorios .

1. Preparación

1. Prepare xilazina-ketamina solución (La ketamina es una sustancia controlada. Registros detallados deben mantenerse y las soluciones de almacenarse en un lugar seguro, bajo llave).
2. Limpiar y esterilizar el equipo.
3. Prepare el área de la cirugía de la limpieza con agente de asepsia y luego cubrir con papel absorbente estéril, y establecer el micromanipulador.

2. Preparación de células para trasplante

1. Las células deben ser resuspendidas a una concentración de 100.000 células / l É y, aunque sólo 250.000 se trasplantan las células por ratón, un exceso de células es necesaria a efectos de carga jeringa (preparar por lo menos 300.000 células por ratón que reciben las células).
2. Lavar las células para ser trasplantadas tres veces en HBSS en un frasco cónico de 50 ml. Contar las células antes de que el giro final.
3. Después de que el giro final hacia abajo, y dejar decantar HBSS vial en posición invertida para evitar que las gotas lleguen a la bolita.
4. Muros de piedra seca en el interior con un irradiados con UV, Kimwipe estéril. No permita que se seque el precipitado.
5. Sosteniendo el tubo en posición vertical, poco a poco y con mucha delicadeza resuspender las células en la mitad del volumen final deseado de HBSS.
6. Medir el volumen total de pipeteado de la mayoría de la suspensión en una punta de pipeta y luego se ajusta el dial de la pipeta de la suspensión hasta que todo está en la punta de la pipeta. Esto le dirá cuánto más HBSS es necesario para la concentración deseada.
7. Aumentar el volumen hasta la cantidad deseada mediante la adición de HBSS.
8. Vuelva a colocar en el hielo. Comprobar la viabilidad de las células si debe estar en el hielo durante más de 2 hrs.

3. Preparación de los ratones para la cirugía y el trasplante

1. Anestesiar el ratón por inyección intraperitoneal de ketamina (100mg/kg) y xilazina (10mg/kg) en dosis de 100 l ~ o un equivalente de anestesia. Todo el procedimiento de la preparación quirúrgica para suturar se de 30-40 minutos.
2. (Opcional: aplicar numeradas, cinta de color a la cola de cada ratón para asegurar la identificación)
3. Afeitar el área dorsal del ratón desde la parte baja del cuello, y se extiende 2 cm bilateral de la línea media, con una maquinilla eléctrica. El pelo se debe cortar lo más cerca posible (puede que sea necesario para revisar el área varias veces).
4. Para eliminar el resto del cabello, aplique una fina capa de crema de depilación (Nair), con un aplicador con punta de gasa.
5. Después de 1-2 minutos, limpie con una gasa de Nair mojada ligeramente con agua y jabón. El área preparada debe limpiar la piel desnuda, sin ninguna pieza perdida de pelo que podría entrar en la herida durante la intervención quirúrgica posterior.
   Esterilizar el área preparada con una solución de yodo.

4. Laminectomía

1. Cambian con frecuencia y / o esterilizar los guantes durante todo el procedimiento. Posición de la parte dorsal del ratón con la cabeza apuntando hacia la izquierda (si eres diestro). Coloque los animales para asegurar la esterilidad y que sólo el área afeitada se expone. Haga una incisión vertical (~ 1,3 cm) sobre el sitio laminecomy que van desde unos vértebras torácicas T8 a T12.
2. Con las pinzas Graefe en la mano izquierda, sujetar firmemente la columna vertebral en T9 (Figura 1) y levante el ratón hacia arriba para exagerar la curvatura de la columna.
3. Usar el bisturí para marcar la unión entre T10 y T11, el espacio entre las dos protuberancias espinosas. Además expone el cruce con cuidado el desguace de la capa muscular para exponer el hueso (ver Figura 1 B, C).
4. Use las tijeras para más músculo clara distancia de la lámina y alrededor del pedículo con tijeras pequeñas. Esto abrirá un pequeño espacio entre las vértebras. Lentamente y con delicadeza insertar una hoja de la tijera en esta brecha y cortar el pedículo. Asegúrese de que la curvatura de la tijera siempre se coloca lateralmente, lejos del cordón. Repetir en el otro lado. (Ver Figura 1 D, E)
5. Levante la lámina para exponer la médula y con cuidado recortar. Asegúrese de no dejar fragmentos de hueso libre o irregulares atrás. (Ver Figura 1 F)
6. Antes de la inyección, limpie la sangre fuera con hisopos de algodón estériles.

5. La inyección de células

1. Coloque la aguja con una aguja tuerca a la jeringa Hamilton y limpiarlas por lavado varias veces con agua, luego de etanol al 70%, y finalmente HBSS. Inserte el émbolo después de cada llenado con agua, etanol al 70%, o HBSS.
2. Prepare la jeringa Hamilton para cargar celulares, eliminando el émbolo y aflojar la tuerca de la aguja y tirar de la aguja fuera de la jeringa para evitar la contrapresión. Asegúrese de que el manejo cuidadoso de la aguja y la tuerca se hace con guantes estériles.
3. 15μl de células de carga en punta de la pipeta y presione firmemente la punta en la parte de atrás de la jeringa para cargar las células en la jeringa.
4. Inserte el émbolo de unos 5 mm y luego apretar la tuerca de la aguja.
5. Presione el émbolo de la ONUhasta que alguna de la suspensión celular se ve salir de la aguja.
6. Asegúrese de que no haya burbujas en la jeringa y coloque la jeringa en posición horizontal para evitar que las células de hacer un gradiente de gravedad.
7. Coge el ratón laminectomized por el músculo dorsal ancho espinales conectan las espinas de T8 y T9 (Figura 2B, C).
8. Abrazadera de la pinza en el brazo izquierdo micromanipulador (vertical) de modo que las patas delanteras del ratón están en el aire y sus patas traseras tocando ligeramente una plataforma de toallas de papel estéril como en las Figuras 2A y 2B.
9. Conecte la jeringa en el brazo derecho micromanipulador (a un ángulo de 70 °) y deslice la jeringa a la posición más baja posible, antes de sujeción.
10. Estabilizar el ratón fijando su cola contra las toallas de papel y baje lentamente la jeringa (Figura 2B).
11. Baje la aguja hacia el cordón y la inserción de la aguja de 1 mm en el hemisferio opuesto a través de la línea media dorsal (Fig. 2C). La punta de la aguja debe estar en la materia gris cerca del canal central.
12. Inyecte lentamente 2.5μl de las células. Inyectar a un ritmo de 1μl / 5 segundos. Después de inyectar las células, espere unos 10 segundos y retirar la aguja de una décima de vuelta a la vez cada 10 segundos hasta que la aguja está fuera de la médula. Preste atención a la posible emanación de la suspensión celular.
13. Rápidamente retirar la jeringa y separarlo del brazo micromanipulador. Coloque la jeringa en posición horizontal.
14. Suelte el ratón y la transferencia a la mesa de sutura.
15. Repita los pasos 5.7 hasta 5.14 para cada ratón hasta que la jeringa se vacía. Esterilizar las herramientas (en el esterilizador) y la aguja (la limpieza con etanol), entre los animales. Deseche las células y recargar si aglutinación es visible.
16. Limpie la jeringa en el paso 5.1 entre las cargas.

6. Puntos de sutura y el cuidado post-operatorio

1. Sutura de la incisión. Aguja de sutura se inserta en la fascia superficial en ambos lados de la incisión. El hilo se encadenan a través de, tirando de la fascia superficial juntos (Figura 3), con lo que cubre la médula espinal expuesta en el sitio de la lámina eliminado. No suturar el músculo cutáneo adheridos a la piel o el músculo esquelético de la espalda. Tirar del hilo a través de toda, dejando aproximadamente 1 / 2 ". Con el porta-agujas, tres nudos se forman y el hilo se corta lo más cerca posible del nudo como sea posible.
2. Cerrar la incisión mediante la aplicación de dos-tres grapas (dependiendo del tamaño de la incisión) en la piel (Figura 3B). Tire con cuidado de la piel lejos del ratón para evitar grapado el músculo subyacente.
3. El uso de un 26G3 / aguja 8 inyectar 0,5 ml de Ringer lactato por vía subcutánea en la espalda baja lejos de la incisión.
4. Lugar del ratón de nuevo en su jaula. Para asegurarse de que es capaz de respirar cómodamente mientras está bajo anestesia, el ratón debe ser colocado en su lado de la jaula, evitando el contacto entre el sitio de la cirugía y camas jaula. Las jaulas deben ser colocados en las compresas calientes.
5. Los ratones son monitoreados después de la anestesia desaparezca para asegurar que cese el sangrado, las suturas permanecen cerradas, y que los ratones que volver a la movilidad antes de la cirugía.
6. Tratar a los ratones una vez con el analgésico buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) después de la cirugía.
7. Asegúrese de que los ratones con discapacidad tengan acceso suficiente a los alimentos y el agua: botellas de agua están equipados con extenderse 3,5 pulgadas caños y los ratones que no pueden caminar a mano agua que se alimenta y / o alta en calorías, suplementos dietéticos (Nutri-Cal, Tomlyn).

7. Los resultados representativos:

Resultados deseados serán identificables por la falta de flujo de salida de la suspensión celular durante la inyección y la aparición intacta de la médula espinal después del procedimiento. Para ello, es vital contar con una iluminación brillante y directo sobre la columna vertebral del ratón durante la laminectomía y durante la inyección. Iluminación óptima se ve facilitada por la iluminación de fibra óptica (Figura 2).

Figura 1 - laminectomía (A) Una vez vértebra T9 está sólidamente mantenidas con las pinzas de Graefe, (B, C) ​​El puntaje de la columna vertebral con el bisturí entre T10 y T11 para facilitar la entrada de las tijeras de micro.. (D) Retire con cuidado las tijeras micro a través del espacio entre T10 y T11 (flechas y cuadro E), y cortar los pedículos en cada lado (los guiones, E) para liberar a la lámina dorsal. (F) Mueva la lámina hasta rostral y córtala.

Figura 2. La inyección de NSCs. (A) La configuración general de la micromanipulador con la pinza mantiene el ratón conectado al brazo izquierdo y la jeringa Hamilton en el brazo derecho en un ángulo de 70 años. (B) La pinza hemostática mantener los músculos espinales dorsal conecta la columna vertebral de T8 y T9. (C) La aguja se baja a través de tque la línea media y en la sustancia gris en el hemisferio opuesto, proximal al canal central.

Figura 3. Suturas y cierre de la herida. (A) Las suturas se aplica a la fascia superficial en ambos lados de la incisión. (B) La incisión se cierra con 2-3 grapas según sea necesario (un alimento básico que aparece en una herida que necesitan 3).

Un trasplante de buena ejecución dependerá principalmente de la laminectomía cuidado y la inyección de las células. El escollo principal para evitar que durante la laminectomía es el daño de la médula espinal. Esto puede ocurrir durante el procedimiento en sí, o por daños causados ​​por los fragmentos de hueso afilados dejado atrás después del procedimiento. Para evitar estos, asegúrese de que los puntos de las tijeras micro curvas son siempre de espaldas a la cuerda y examinar cuidadosamente la columna laminectomized para asegurarse de que todos los fragmentos óseos se borran y que los bordes de la estructura vertebral restantes no han salido o abiertamente irregular.

Como se mencionó anteriormente, la detección de flujo de salida será posible si la luz está brillando y directamente en la médula espinal expuesta durante la inyección. Flujo de salida es más probable que ocurra con agujas de calibre 30 (frente al 33 calibre) y si la inyección se hace con demasiada rapidez. Aunque este protocolo nos ha dado buenos resultados, otros han informado de espera más largos períodos (hasta 5 minutos) antes de retractarse de la aguja de inyección después de ^8,9. Además, pequeñas agujas de calibre son preferibles, pero hemos observado que algunas células se lisaron con demasiada facilidad cuando pasa a través de agujas de calibre 33.

Para maximizar la eficiencia, un equipo de trasplante dotación de las cuatro estaciones diferentes (ratón de preparación, la laminectomía, inyecciones y suturas) es deseable. Además, el calendario para cada procedimiento debe ser optimizado para minimizar el tiempo que las células están esperando en el hielo. Por ejemplo, trasplante de nuestros ratones en grupos de cuatro (el número de dosis en cada carga de la jeringa), la persona inyección de células empieza a cargar la jeringa después de que el ratón ha sido tercero laminectomized y la persona que prepara los ratones debe anestesiar a los siguientes grupo después de que el segundo ratón del grupo anterior se ha laminectomized. De esta manera, se puede trasplantar células (o medios de control) en 40 ratones en alrededor de 3 horas a pesar de que cada ratón se llevará a aproximadamente 30-40 min.

Terapias de reemplazo celular para el tratamiento de algunos trastornos del SNC se encuentran actualmente en ensayos clínicos ^10. No hay sustituto para los modelos in vivo de la NSC y el trasplante de nuestro protocolo para el injerto de NSCs en la médula espinal de ratones con desmielinización viral inducida facilita el uso de un modelo importante de la EM y también se puede adaptar fácilmente a otros modelos.

No hay conflictos de interés declarado.

1. Bergmann, C.C., Lane, T.E. & Stohlman, S.A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol 4 (2), 121-132 (2006).
2. Weiner, H.L. The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease? Ann Neurol 65 (3), 239-248 (2009).
3. Fleming, J.O., Trousdale, M.D., Bradbury, J., Stohlman, S.A. & Weiner, L.P. Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease. Microb Pathog 3 (1), 9-20 (1987).
4. Totoiu, M.O., Nistor, G.I., Lane, T.E. & Keirstead, H.S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol 187 (2), 254-265 (2004).
5. Carbajal, K.S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J. & Lane, T.E. Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A 107 (24), 11068-11073 (2010).
6. Hardison, J.L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H.S. & Lane, T.E. Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response. Exp Neurol 197 (2), 420-429 (2006).
7. Blakemore, W.F. & Crang, A.J. Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. (Oxford UP, Oxford, 1992).
8. Liu, S., et al. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A 97 (11), 6126-6131 (2000).
9. Keirstead, H.S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. J Neurosci 25 (19), 4694-4705 (2005).
10. Mayor, S. First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury. BMJ 341, c5724 (2010).

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