Transplante de Células-Tronco cirúrgica do rato Neural na medula espinhal de camundongos infectados com o vírus da Hepatite neurotrófico rato

Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834, doi:10.3791/2834 (2011).

Camundongos infectados com a cepa JHM neurotrópica do mouse vírus da hepatite (MHV) Desenvolver resultados patológicos e clínicos semelhantes aos pacientes com a doença desmielinizante Esclerose Múltipla (MS). Nós mostramos que o transplante de NSCs na medula espinhal de ratos doentes resultados em uma melhora significativa em ambos os remielinização e no resultado clínico. Terapias com células de substituição para o tratamento de doenças neurológicas crônicas são agora uma realidade e em modelos in vivo são vitais para a compreensão das interacções entre as células enxertadas e microambiente tecido hospedeiro. Esta apresentação fornece um método adaptado para o transplante de células na medula espinhal de ratos infectados JHMV. Em resumo, nós fornecemos um procedimento para i) preparação de NSCs antes do transplante, ii) pré-operatório de ratos, iii) a exposição da medula espinhal através de laminectomia, iv) a injeção estereotáxica de NSCs, e iv) cuidados pós-operatórios .

1. Preparação

1. Prepare xilazina-cetamina solução (ketamina é uma substância controlada. Registros detalhados devem ser mantidos e soluções armazenadas em um local seguro e trancado).
2. Limpar e esterilizar equipamentos.
3. Prepare área da cirurgia, limpando com o agente de assepsia e, em seguida, cobrir com papel toalha estéril, e configurar o micromanipulador.

2. Preparação de células para transplante

1. As células devem ser ressuspendidas a uma concentração de 100.000 células / l E e, apesar de apenas 250.000 células são transplantadas por mouse, um excesso de células é necessário para fins de seringa de carga (preparar pelo menos 300 mil células por camundongo que receberam células).
2. Lave as células a serem transplantadas 3 vezes em HBSS num frasco de 50 ml. Contar as células antes do spin-final.
3. Após a centrifugação final para baixo, e deixar decantar HBSS frasco em posição de cabeça para baixo para evitar que gotas de alcançar o sedimento.
4. Seca paredes interiores com um UV-irradiados Kimwipe, estéril. Não permita que o pellet para secar.
5. Segurando o tubo na posição vertical, lenta e delicadamente ressuspender as células em metade do volume final desejado de HBSS.
6. Medir o volume total por pipetagem a maioria da suspensão em uma ponta da pipeta e então ajustando o dial na pipeta até a suspensão inteira está na ponta da pipeta. Isso vai te dizer o quanto HBSS mais é necessário para a concentração desejada.
7. Traga de volume para a quantidade desejada, adicionando HBSS.
8. Coloque de volta no gelo. Verificar a viabilidade das células se deve ser sobre o gelo por mais de 2 hrs.

3. Preparação de ratos para a cirurgia e transplante

1. Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de ketamina (100mg/kg) e xilazina (10mg/kg) em ~ 100 mL doses ou por um anestésico equivalente. Todo o processo de preparação cirúrgico para sutura terá de 30-40 minutos.
2. (Opcional: aplique fita numerada, colorido para a cauda de cada rato para assegurar a identificação)
3. Raspar a área dorsal do mouse a partir da parte inferior das costas para o pescoço, e estendendo dois centímetros da linha média bilateral, com tosquiadeiras elétricas. O cabelo deve ser cortado o mais próximo possível (pode ser necessário para ir sobre a área várias vezes).
4. Para remover os pêlos restantes, aplique uma camada fina de creme de depilação (Nair) com uma gaze aplicador derrubado.
5. Depois de 1-2 minutos, limpe Nair off com gaze umedecida levemente com água e sabão. A área preparada deve ser limpa a pele nua, sem peças perdidas de cabelo que poderiam entrar na ferida durante o procedimento cirúrgico subseqüente.
   Esterilizar a área preparada com solução de iodeto.

4. Laminectomia

1. Mudam freqüentemente e / ou esterilizar as luvas durante o procedimento. Posição ao lado do mouse dorsal com a cabeça apontando para a esquerda (se você for destro). Drape animais para garantir a esterilidade e que apenas a área raspada está exposto. Faça uma incisão vertical (~ 1,3 cm) sobre o local laminecomy spanning de cerca de vértebras torácicas T8 a T12.
2. Com a pinça zu na mão esquerda, prender firmemente a coluna vertebral em T9 (Figura 1A) e levante o mouse até a exagerar a curvatura da coluna vertebral.
3. Use o bisturi para marcar a junção entre T10 e T11, o espaço entre as duas saliências espinhosas. Ainda expor a junção com cuidado a demolição da camada muscular para expor o osso (ver Figura 1B, C).
4. Use a tesoura para mais músculo clara distância da lâmina e em torno do pedículo com snips pequenos. Isto irá abrir um pequeno espaço entre as vértebras. Lenta e delicadamente inserir uma lâmina da tesoura para essa lacuna e snip do pedículo. Certifique-se a curvatura da tesoura é sempre posicionados lateralmente, longe do cabo. Repita no outro lado. (Ver Figura 1D, E)
5. Levante a lâmina para expor o cabo e cuidadosamente snip-lo. Não se esqueça de deixar qualquer fragmentos de ossos livre ou irregulares para trás. (Ver Figura 1F)
6. Antes da injeção, limpar o sangue para fora com cotonetes estéreis.

5. Injeção de células

1. Coloque a agulha com agulha porca para a seringa Hamilton e limpá-los através de lavagem com água várias vezes, então 70% de etanol e, finalmente, HBSS. Inserir êmbolo após cada enchimento com água, etanol 70%, ou HBSS.
2. Prepare a seringa Hamilton para carregar celular através da remoção do êmbolo e soltando a porca agulha e puxando a agulha para longe da seringa para evitar contrapressão. Garantir que a manipulação cuidadosa da agulha e porca é feito com luvas estéreis.
3. Carga 15μl de células em pipeta ponta e pressione a ponta firmemente na extremidade traseira da seringa para carregar as células dentro da seringa.
4. Insira o êmbolo aproximadamente 5mm e, em seguida, apertar a porca da agulha.
5. Deprimem êmbolo unaté alguns da suspensão de células foi visto saindo da agulha.
6. Certifique-se que não há bolhas na seringa e colocar a seringa na posição horizontal para evitar que as células de fazer um gradiente de gravidade.
7. Agarrar o mouse laminectomized pelo músculo spinalis dorsi conectando os espinhos de T8 e T9 (Figura 2B, C).
8. Prender o hemostat para o braço esquerdo micromanipulador (vertical) para que as patas da frente do rato estão no ar e suas patas traseiras tocando levemente uma plataforma de toalhas de papel estéreis, nas Figuras 2A e 2B.
9. Conecte a seringa no braço direito micromanipulador (em um ângulo de 70 °) e deslize a seringa na posição mais baixa possível, antes de aperto.
10. Estabilizar o mouse fixando sua cauda contra as toalhas de papel e abaixe lentamente a seringa (Figura 2B).
11. Abaixe a agulha em direção ao cabo e insira a um milímetro agulha no hemisfério oposto através da linha média dorsal (Figura 2C). A ponta da agulha deve ser na substância cinzenta perto do canal central.
12. Injecte lentamente 2.5μl de células. Injetar a uma taxa de 1μl / 5 segundos. Depois de injetar as células, espere uns 10 segundos e retirar a agulha 1 / 10 de uma volta em um momento cada 10 segundos até que a agulha está fora do cordão. Preste atenção ao efluxo possível de suspensão celular.
13. Rapidamente retirar a seringa e retire-a do braço micromanipulador. Lay a seringa horizontalmente.
14. Solte o mouse e transferência para a mesa sutura.
15. Repita os passos 5,7-5,14 para cada rato até que a seringa é esvaziada. Esterilizar as ferramentas (no esterilizador) ea agulha (limpando com álcool) entre os animais. Descartar pilhas e recarregar se aglomeração é visível.
16. Limpe a seringa como no passo 5,1 entre as cargas.

6. Suturas e pós-operatório de cuidados

1. Suturar a incisão. Agulha de sutura é inserida na fáscia superficial em ambos os lados da incisão. O fio é amarrada através de, puxando fáscia superficial juntos (Figura 3A), cobrindo assim a medula espinal exposta no local da lâmina removido. Não sutura do músculo cutâneo ligado à pele ou do músculo esquelético das costas. Puxe a linha através de todo, deixando cerca de 1 / 2 ". Usando o porta-agulha, três nós são formados e linha é cortada o mais próximo do nó possível.
2. Fechar a incisão através da aplicação de 2-3 grampos (dependendo do tamanho da incisão) para a pele (Figura 3B). Puxe cuidadosamente a pele longe do mouse para evitar grampear o músculo subjacente.
3. Usando um 26G3 / 8 agulha injetar 0,5 ml de Ringer Lactato de sub-cutânea na região lombar longe da incisão.
4. Colocar o mouse de volta em sua gaiola. Para garantir que ele é capaz de respirar confortavelmente enquanto sob anestesia, o mouse deve ser colocado de lado na gaiola, evitando o contato entre o local da cirurgia e roupa de cama gaiola. Gaiolas devem ser colocados em almofadas de aquecimento.
5. Ratos são monitorados após a anestesia desgasta fora para garantir subsídios sangramento, suturas permanecem fechadas, e que os ratos voltar ao pré-cirurgia de mobilidade.
6. Tratar ratos um tempo com a buprenorfina analgésico (0,05-0,1 mg / kg) após a cirurgia.
7. Garantir camundongos deficientes têm acesso suficiente a alimentos e água: garrafas de água estão equipados com bicos estendida 3,5 polegadas e ratos que são incapazes de andar de mão são alimentados de água e / ou de alto teor calórico suplemento dietético (Nutri-Cal, Tomlyn).

7. Resultados representativos:

Resultados desejados será identificável pela falta de efluxo da suspensão de células durante a injeção e pelo aparecimento intactas da medula espinhal após o procedimento. Para este fim, é vital ter uma iluminação brilhante e direta na coluna do rato durante a laminectomia e durante a injeção. A iluminação ideal é facilitada pela iluminação de fibra óptica (Figura 2A).

Figura 1 - Laminectomia (A) Uma vez vértebra T9 está solidamente realizada com a pinça Graefe, (B, C) ​​pontuação da coluna vertebral com bisturi entre T10 e T11 para facilitar a entrada da tesoura micro.. (D) Deslize cuidadosamente a tesoura micro através do espaço entre T10 e T11 (setas e inset, E) e cortar os pedículos de cada lado (traços, E) para libertar a lâmina dorsal. (F) Virar a lâmina até rostralmente e cortá-lo.

Figura 2. Injeção de NSCs. (A) A configuração geral do micromanipulador com o hemostat segurando o mouse conectado ao braço esquerdo e na seringa Hamilton no braço direito em um ângulo de 70. (B) O hemostat segurar o spinalis dorsi conectando os espinhos de T8 e T9. (C) A agulha é reduzido através de tele linha média e na matéria cinzenta no hemisfério oposto, proximal ao canal central.

Figura 3. Suturas e fechamento da ferida. (A) Suturas são aplicados à fáscia superficial em ambos os lados da incisão. (B) A incisão é fechada com grampos 03/02, conforme necessário (um grampo mostrado em uma ferida que necessitam 3).

Um transplante bem executado vai depender principalmente na laminectomia cuidadoso e injeção das células. A armadilha primário para evitar durante uma laminectomia é o prejudicial da medula espinhal. Isso pode ocorrer durante o procedimento em si ou por danos causados ​​por fragmentos de ossos afiados deixado para trás após o procedimento. Para evitar essas, garantir que os pontos da tesoura curva micro são sempre de costas para o cabo e examinar cuidadosamente a espinha laminectomized para garantir que todos os fragmentos de ossos são limpos e que as bordas da estrutura remanescente vertebral não tem abertamente salientes ou irregulares.

Como mencionado anteriormente, a detecção de efluxo será possível se a luz está brilhando e diretamente na medula espinal exposta durante a injecção. Efluxo é mais provável que isso aconteça com 30 agulhas (versus 33 gauge) e se a injeção é feita muito rapidamente. Embora este protocolo tem nos dado bons resultados, outros têm relatado mais períodos de espera (até 5 minutos) antes de retrair a agulha de injeção seguinte ^8,9. Além disso, as agulhas bitola menor são preferíveis, mas temos observado que algumas células são facilmente lisadas quando passou por 33 agulhas.

Para maximizar a eficiência, a equipe de transplante lotação as quatro estações diferentes (mouse prep, laminectomia, injeção, e suturas) é desejável. Além disso, o tempo para cada processo deve ser otimizado para minimizar o tempo as células estão esperando no gelo. Por exemplo, nós transplante de nossos ratos em grupos de quatro (o número de doses em cada carga da seringa), a pessoa injetar as células começa a carregar a seringa após o mouse terceiro foi laminectomized ea pessoa deve preparar os ratos anestesiar o seguinte grupo após o segundo rato do grupo anterior foi laminectomized. Desta forma, podemos transplante de células (ou controle de mídia) em 40 camundongos em cerca de 3 horas, apesar de cada rato terá aproximadamente 30-40 min.

Terapias com células de substituição para o tratamento de algumas doenças do SNC estão actualmente em ensaios clínicos ^10. Não há substituto para modelos in vivo de transplante e NSC nosso protocolo para o enxerto de NSCs na medula espinhal de ratos com desmielinização induzida viral facilita o uso de um modelo importante de MS e também pode ser facilmente adaptado para outros modelos.

Não há conflitos de interesse declarados.

1. Bergmann, C.C., Lane, T.E. & Stohlman, S.A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol 4 (2), 121-132 (2006).
2. Weiner, H.L. The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease? Ann Neurol 65 (3), 239-248 (2009).
3. Fleming, J.O., Trousdale, M.D., Bradbury, J., Stohlman, S.A. & Weiner, L.P. Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease. Microb Pathog 3 (1), 9-20 (1987).
4. Totoiu, M.O., Nistor, G.I., Lane, T.E. & Keirstead, H.S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol 187 (2), 254-265 (2004).
5. Carbajal, K.S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J. & Lane, T.E. Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A 107 (24), 11068-11073 (2010).
6. Hardison, J.L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H.S. & Lane, T.E. Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response. Exp Neurol 197 (2), 420-429 (2006).
7. Blakemore, W.F. & Crang, A.J. Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. (Oxford UP, Oxford, 1992).
8. Liu, S., et al. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A 97 (11), 6126-6131 (2000).
9. Keirstead, H.S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. J Neurosci 25 (19), 4694-4705 (2005).
10. Mayor, S. First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury. BMJ 341, c5724 (2010).

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